极低频电磁场(ELF EMF)通常是指频率为0—300Hz的交变电磁场。工频磁场是一类由50 Hz或60 Hz交变电流所产生的极低频电磁场，其通常存在于家用电器、工农业电器设备及输变电设施周围。伴随着电力事业的发展以及各类电器设备的广泛应用，人类工作与生活环境中的工频磁场日益增强，逐渐成为继水、空气、固体垃圾污染之后的又一主要环境污染源，并已被联合国人类环境会议列为必须控制的污染。众多的研究表明，工频磁场作为一类普遍存在的物理刺激因子可诱导生物体产生多种生物效应，其暴露可能与肿瘤的发生，心血管、内分泌等系统疾患以及生殖和发育的异常相关，因而引起了研究人员的广泛关注和公众的迫切关心，但是，工频磁场诱导的生物效应的机制至今尚未阐明。因此，探索外界工频磁场究竟通过何种机制将自身的物理信号传递给生物体，并产生相应的生物学效应，已成为该研究领域急需解决的难题。有关的研究显示，各类外界刺激因子所诱导的受体聚簇是膜受体及其下游信号通路活化的基础。我们以往的研究发现，50 Hz工频磁场不仅可诱导细胞膜表面的表皮生长因子受体(EGFR)和肿瘤坏死因子受体(TNFR)发生聚簇，而且，工频磁场诱导的EGFR聚簇与细胞膜上富含鞘脂类和胆固醇的脂筏结构(lipid rafts)的融合汇集密切相关。因此，我们推测细胞膜上的受体以及脂筏结构可能是工频磁场作用于细胞并发生信号转导的关键作用位点。相关的研究结果提示，胞膜上脂筏结构的聚集以及膜受体的聚簇与胞膜中酸性鞘磷脂酶(A-SMase)的活性和神经酰胺(Ceramide)的含量具有密切的相关性。配体及非配体等众多外界刺激因素诱导的脂筏结构聚集以及相关受体的聚簇往往是外界刺激因子激活跨膜信号转导的一大共同机制.有研究表明，外界刺激因子诱导受体聚簇通常遵循类似的作用过程：包括刺激因子作用下诱导胞内的A-SMase活化、易位至细胞膜，水解脂筏中的鞘磷脂产生神经酰胺，诱导脂筏结构融合汇集，最终导致脂筏上相应受体发生聚簇。这些非配体刺激因素中也包括了与工频磁场同为电磁辐射的紫外线UV-C，电离辐射Y射线等物理刺激因素。神经酰胺作为体内一种重要的第二信使，由其为基本组成单位构成的神经鞘磷脂是细胞膜的基本组成成分。随着细胞跨膜信号通路研究的不断深入，发现鞘脂类物质，特别是神经酰胺在细胞信号转导等诸多方面扮演着重要的角色。而酸性鞘磷脂酶活化、易位后可以水解胞膜中的鞘磷脂产生神经酰胺。相关的研究发现，环境中的许多刺激因子可通过诱导细胞内的活性氧水平(ROS)发生增高而致使酸性鞘磷脂酶发生活化和易位，ROS与酸性鞘磷脂酶的活化具有密切相关性。我们在以往的研究中观察到工频磁场可导致酸性鞘磷脂酶易位至胞膜上，并与脂筏发生共定位，因此，我们推测酸性鞘磷脂酶以及神经酰胺和ROS在工频磁场诱导的受体聚簇中发挥着重要作用。 　　 本研究以0.4 mT的工频磁场辐照处理人羊膜(FL)细胞，利用激光共聚焦显微镜免疫荧光技术较系统地探讨A-SMase和神经酰胺在工频磁场诱导细胞膜受体聚簇中的作用；并采用活性氧检测技术初步地分析工频磁场辐照对FL细胞内活性氧产生的影响。采用免疫组织化学荧光标记技术结合激光共聚焦显微镜观察，并引入酸性鞘磷脂酶的抑制剂——丙咪嗪(Imipramine)以研究酸性鞘磷脂酶活性与工频磁场诱导的FL细胞膜受体聚簇之间的关系。实验时，FL细胞接种于置有盖玻片的φ35 mm的培养皿中，随机分为Imipramine预处理组(Imipramine溶于二甲亚砜配成母液，实际使用中稀释至50μmol/L预处理4h)、二甲亚砜溶剂预处理组(预处理4h)和常规培养组(非预处理组)。每组细胞再各设3种处理组，分别为：(1)假辐照组，不作任何处理；(2)磁场辐照组，0.4 mT工频磁场持续辐照15 min；(3)EGF阳性对照组，100 ng/ml EGF处理15 min。处理后的细胞依次以PBS漂洗，4％多聚甲醛固定，羊血清封闭，抗体标记以及封片，最后以激光共聚焦显微镜观察FL细胞膜EGF受体聚簇的变化，同时对细胞膜受体聚簇的百分比进行统计分析。结果显示常规培养及DMSO溶剂预处理组中，EGF处理和0.4 mT工频磁场辐照15min均能诱导细胞产生明显的EGF受体聚簇现象，围绕细胞表面呈明亮的、聚集状的绿色荧光团，或形成极性帽状光团；而假辐照细胞的EGF受体基本呈均匀分散分布荧光小点，几乎不出现聚集状的光团。细胞计数结果表明，与假辐照组相比，工频磁场辐照组及EGF处理组中发生受体聚簇细胞的百分比均显著增加。当细胞经过丙咪嗪预处理4h后，细胞受体聚簇现象则减弱或消失。发生受体聚簇细胞的百分比也明显减少，与假辐照相比，差异无统计学意义，基本恢复至本底水平。溶剂DMSO对细胞表面EGF受体聚簇的发生率没有影响。表明工频磁场诱导的FL细胞受体聚簇与酸性鞘磷脂酶活性具有密切的相关性。采用免疫组织化学荧光标记技术以及激光共聚焦显微镜观察方法，来分析神经酰胺对工频磁场诱导细胞膜受体聚簇的影响。接种于含有盖玻片的培养皿中的细胞经丙咪嗪预处理4h之后，被随机分为C2-神经酰胺处理组(神经酰胺溶于DMSO配成母液，实际使用中稀释至50μg/ml预处理30 min)及常规培养(非处理组)。每组再各设3种处理组，分别为：(1)假辐照组，不作任何处理；(2)磁场辐照组，0.4 mT工频磁场持续辐照15 min；(3)EGF阳性对照组，100 ng/ml EGF处理15 min。结果显示丙咪嗪预处理4h后，EGF处理和0.4 mT工频磁场辐照15 min均不能增强细胞EGF受体聚簇，与假辐照相比，差异无统计学意义(P>0.05)。丙咪嗪预处理4 h后的细胞再经神经酰胺预处理30 min，EGF处理组和0.4 mT工频磁场辐照组均能观察到较为明显的EGF受体聚簇现象。与假辐照组相比，工频磁场辐照组及EGF处理组中发生受体聚簇细胞的百分比均显著增加。结果表明，神经酰胺作为A-SMase的水解产物可能参与了工频磁场诱导的FL细胞膜受体聚簇。应用细胞内活性氧检测技术对0.4 mT工频磁场辐照处理下Fl细胞内的活性氧水平进行探索。FL细胞培养24 h后，加载相应浓度的荧光探针DCFH-DA，然后分为5组，分别为：(1)假辐照组，不作任何处理；(2)磁场辐照组，0.4 mT，50Hz工频磁场分别持续辐照5、15或30 nun；(3)阳性对照组，活性氧阳性对照试剂处理30 min。每次实验每组均设8个复孔，同时每组都设立相同数量不加荧光探针DCFH-DA，而其它条件相同的背景孔(组).辐照组细胞在距收获前相应的时间放置于辐照系统中进行辐照，所有细胞同时收获。收获后利用荧光酶标仪对各组细胞内的活性氧水平进行检测并对细胞内活性氧水平的变化情况进行t检验统计分析。结果显示，经0.4 mT工频磁场辐照处理5，15或30 min后，FL细胞内的活性氧水平有增加的趋势，与假辐照组相比均具有显著统计学意义(p<0.05，p<0.01)。该部分结果表明工频磁场辐照可显著增加FL细胞内的活性氧水平。 　　 研究表明：⑴工频磁场诱导FL细胞膜表面EGF受体聚簇与A-SMase的活性密切相关。⑵神经酰胺作为‘A-SMase的水解产物可能参与了工频磁场诱导的受体聚簇。⑶0.4 mT工频磁场辐照能显著提高FL细胞内的活性氧(ROS)水平。