论文部分内容阅读
长链多不饱和脂肪酸（LC-PUFA），如花生四烯酸（AA）、二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）等，是维持鱼体正常生长发育的必需脂肪酸。一般认为，淡水鱼可以通过脂肪酸的去饱和及碳链延长作用将C18的亚油酸和亚麻酸转化为长链多不饱和脂肪酸，如大西洋鲑鱼（Salmo salar）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）；而海水鱼的这种能力缺乏或很弱。本课题组在杂食性海水鱼黄斑蓝子鱼（Siganus canaliculatus）中首次发现并证明海水鱼具有转化亚油酸和亚麻酸为LC-PUFA的能力，且该种能力在低盐环境中要比高盐环境中强（Li et al.,2008,2010），研究表明降河洄游鱼类日本鳗鲡也具有将LA和ALA转为LC-PUFA的合成能力（Wang et al., in press）；另外发现海水肉食性鱼类塞内加尔鳎（Solea senegalensisKaup）可能具有利用亚麻酸合成二十二碳六烯酸的能力（Navarro-Guillén et al.,2014）。这些现象说明，鱼类LC-PUFA合成能力与鱼类的食性和生境有关。为了深入探讨生境和食性影响鱼类LC-PUFA合成能力的原因，本论文以五种不同食性和生境鱼类为对象，包括植食性淡水鱼草鱼（Ctenopharyngodon idellus）、杂食性海水鱼黄斑蓝子鱼（Siganus canaliculatus）、肉食性海水鱼斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）、溯河洄游大西洋鲑鱼（Salmo salar）、降河性洄游鱼类日本鳗鲡（Anguilla japonica），对不同鱼类的两种LC-PUFA合成关键酶即Δ6脂肪酸去饱和酶（Δ6 Fad）和碳链延长酶5（Elovl5）的活性进行比较研究。主要研究内容和结果如下： 1.采用RT-PCR方法获得上述5种鱼的Δ6 Fad和Elovl5的cDNA序列。除斜带石斑鱼去饱和酶的基因序列与已报道的序列（EU715405）有一个氨基酸差异外，其它基因序列与已报道的一致。 2.利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表达系统，对他人已克隆但并未进行功能确认的草鱼去饱和酶（杜嵇华等，2011）和延长酶（HQ637463）以及斜带石斑鱼的去饱和酶（EU715405）的基因进行了功能鉴定。结果显示，草鱼去饱和酶具有Δ6 Fad功能活性，其延长酶具有Elovl5功能活性；斜带石斑鱼去饱和酶没有活性。 3.对不同鱼类去饱和酶预测功能区域的氨基酸序列进行比较分析发现：大多数鱼类去饱和酶的第333和378位置的氨基酸分别为丙氨酸和谷氨基酸，而斜带石斑鱼的分别是亮氨酸和赖氨酸。这两个位置的氨基酸发生突变可能是斜带石斑鱼去饱和酶没有活性的原因。 4.引入参比基因绿色荧光蛋白（pEGFP-C3），探索定量分析比较不同鱼类HUFA合成关键酶活性的方法。结果发现，无论是将绿色荧光蛋白的EGFP基因插到重组质粒pYES2-ORF，关键酶基因ORF的前端或者末端，Δ6 Fad或Elovl5基因的表达产物都没有活性。最后确定双质粒共转染的方法进行Δ6 Fad或Elovl5酶活性的定量比较研究，将重组质粒和pEGFP-C3质粒按体积比10:1进行转染，表达产物有活性且表达量最高。 5.对四种鱼（草鱼、黄斑蓝子鱼、大西洋鲑鱼、日本鳗鲡）的Δ6 Fad及Elovl5的酶活性进行定量比较的结果显示，Δ6 Fad的酶活性从大到小依次是，淡水植食性的草鱼、降河洄游的日本鳗鲡、溯河洄游的大西洋鲑鱼、杂食性偏植食性的黄斑蓝子鱼，Elovl5酶活性最高的为杂食性偏植食性的黄斑蓝子鱼，而酶活性最低的为淡水植食性的草鱼。 本研究的结果说明，食性和生境可以影响鱼类LC-PUFA合成关键酶的活性。其中，食性和生境对Δ6 Fad的酶活性影响较大，且在淡水植食性鱼类（草鱼）中Δ6 Fad的酶活性较高。Elovl5酶活性受生境的影响不是很明确，但拥有丰富食物源的黄斑蓝子鱼Elovl5酶活性最高，食性有利于Elovl5酶活性的提高。不论是Δ6 Fad还是Elovl5，其酶活性都显示出对n-3系列脂肪酸底物的偏好性。本研究结果可为揭示鱼类LC-PUFA合成调控机制提供理论依据，对于丰富鱼类营养学、特别是分子营养学内容具有重要的理论意义和学术价值。