在全世界,胃癌是严重威胁人类健康的最常见恶性肿瘤之一,我国又是胃癌高发国家,因此,阐明影响胃癌发生和发展的相关因素,这对于提高胃癌防治水平具有重要的意义。众所周知,影响胃癌预后的临床因素很多,例如年龄、性别、肿瘤发生部位、肿瘤病理类型、TNM分期以及术后是否化疗等都可能影响胃癌的预后。目前,一方面在临床上除TNM分期之外尚缺乏其它能准确判断胃癌患者预后的新指标,而另一方面,在有着相同TNM分期的患者间,其预后仍存在显著差异。因此,进一步研究并发现判断胃癌患者预后的可靠指标是当前恶性肿瘤防治研究所必须面对的重要内容。维生素D（其活性形式为1,25双羟维生素D3,1,25（OH）2D3）是一种脂溶性的类固醇衍生物,是人体必需的营养物质之一。近年来的研究发现,除调节体内钙磷代谢和维持血钙等传统功能外,维生素D可通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞分化以及促进细胞凋亡等方式发挥抗肿瘤作用。大量的流行病学研究亦证实,外周血维生素D浓度与结直肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌等多种肿瘤预后相关。目前,因为缺少系统的、较大样本量的流行病学证据,因此维生素D胃癌预后的关系则不得而知。本研究以胃癌患者的血浆维生素D浓度检测为切入点,从遗传学角度系统地研究维生素D与胃癌预后的关系,以期能提供判断胃癌预后的新指标,进而为恶性肿瘤的诊断和治疗提供新线索。基于以上思考,本研究利用公共数据库的大样本量的人群数据以及实验室的基因组学研究结果,进行了系统的血浆维生素D和胃癌预后的关联实验研究,同时,我们根据其相应的基因多态性及microRNA的结合预测,提供了维生素D影响胃癌预后的流行病学和基因组学的双重证据。第一部分 胃癌预后与患者居住地紫外线指数的关联研究大量的体外功能学实验已证实,除参与调控钙磷代谢外,维生素D可以通过多种机制发挥其抗肿瘤作用。流行病学研究也发现,高浓度的血浆维生素D可以明显降低结直肠癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤的患病率和死亡率。然而,目前缺少大样本量的维生素D与胃癌患者预后相关关系的研究。美国国立癌症研究所的“监测,流行病学和最终结局”数据库（SEER）,是北美最具代表性的大型肿瘤登记数据库之一。因为该数据库收集了多种肿瘤相关的大量的循证医学数据,这为临床医学研究和临床医师的询证实践研究提供了详实可靠的数据支持。研究证实,人体内维生素D水平除饮食摄入补充外,经紫外线照射后7-脱氢胆固醇的化学转变也是一大重要来源,因此居住在高纬度地区的人群较易出现维生素D的缺乏。流行病学的相关研究发现,包括结直肠癌、肺癌等多种肿瘤的预后与患者居住地区的紫外线指数或纬度高低有关,高纬度地区肿瘤患者的预后相对较差。本研究首先分析了 SEER数据库1988-2010年间、来自美国18个地区的46,388例新发胃癌患者的预后信息,研究不同居住地区紫外线指数与胃癌患者预后的关系,以期发现维生素D与胃癌患者预后的间接流行病学证据。本研究采用Kaplan-Meier法计算中位生存时间,以log-rank检验比较不同亚组生存情况的差异。运用单因素及多因素的Cox回归分析对胃癌患者总生存期（Overall Survival,OS）与紫外线指数进行关联分析,并校正年龄、性别、种族、婚姻情况、收入水平、诊断年份、手术情况、TNM分期、肿瘤位置和病理类型。关联强度以风险比（Hazard Ratio,HR）及其95%可信区间（CI）表示。同时,我们依据美国国家航空航天局（NASA）提供的卫星监测数据,获得了 2000-2010年间SEER数据库登记的18个地区的年平均紫外线B辐射指数（UVB）,并按其排序将胃癌患者分为两组—一高紫外线指数地区（31,970人）以及低紫外线指数地区（14,418人）。研究发现两组间胃癌患者的中位生存期存在显著差异（高紫外线地区vs.低紫外线地区,13.00±0.15 vs.12.00±0.19,log-rank 检验P＜0.001）。考虑到美国属于多种族混居地区,不同人种间对紫外线的吸收能力存在较大差异,我们进而将样本再进一步分为非西班牙裔白人、非西班牙裔黑人、非西班牙裔其他人以及西班牙裔人四组进行单因素/多因素Cox回归分析。我们的研究发现,与高紫外线指数组相比,除非西班牙裔黑人外,在其他三个人种的亚组中,均表现出胃癌患者预后与紫外线指数的显著相关,即高紫外线指数地区胃癌患者的预后明显好于其他亚组（调整后:非西班牙裔白人,HR=1.05,P=0.001;非西班牙裔黑人,HR=0.98,P=0.613;非西班牙裔其他人,HR=1.25,P=2.2× 10-5;西班牙裔人,HR=1.08,P=0.024）。在进一步的分层分析中我们发现,在不同人种的多个亚组中均存在相同的效应,未见明显的亚组中异质性（P异质性>0.05）。综上所述,本研究基于美国SEER数据库的大样本量人群研究,通过引入不同地区紫外线辐射指数将研究对象分为紫外线指数高/低两组,比较不同组之间的胃癌患者预后生存差异,提供了维生素D可能影响胃癌患者预后的间接流行病学证据。第二部分 血浆维生素D与胃癌预后及化疗骨髓抑制程度的关联研究在第一部分的研究中,我们通过对美国SEER数据库的分析,证实了 UVB与胃癌患者预后之间存在明显的关系,这也暗示机体维生素D浓度可能与胃癌患者预后相关,基于此考虑,我们进一步探讨了胃癌患者血浆维生素D浓度与其预后之间的关系,以期能证实胃癌患者血浆维生素D浓度可以影响胃癌预后。本研究选取了 2007年1月至2011年12月间,来自南京医科大学第一附属医院及江苏大学附属医院（镇江）的785例经组织病理学或细胞学确诊的新发胃癌病人。使用DiaSorn公司的全25-OHD放射免疫法（Stillwater,MN,USA）测定患者的血浆25-OHD浓度,结合并分析患者详细的近/远期预后,探讨胃癌患者初诊时血浆25-OHD浓度与胃癌预后的关系。采用Kaplan-Meier法计算中位生存时间,以log-rank检验比较不同亚组生存情况的差异,以多元线性回归来研究血浆25-OHD浓度与化疗骨髓抑制程度的关系。运用单因素及多因素的Cox回归分析对胃癌患者无进展生存期（Progression Free Survival,PFS）及总生存期（Overall Survival,OS）与血浆25-OHD浓度进行关联分析,并校正年龄、性别、吸烟/饮酒情况、BMI、TNM分期、手术方式、肿瘤位置以及抽血季节。关联强度以风险比（Hazard Ratio,HR）及其95%可信区间（CI）表示。在558例Ⅰ-Ⅲ期的胃癌患者中,我们首先分析了血浆25-OHD浓度与患者PFS的关系。Cox 比例风险回归模型结果显示,高25-OHD浓度组（25-OHD浓度≥42.48 nmol/L）的PFS要明显优于低浓度组（25-OHD浓度<42.48 nmol/L）,该结果调整前后均表现一致（调整前HR=0.68,P=0.003;调整后HR=0.63,P=0.001）。接着我们根据患者的年龄、性别、吸烟/饮酒情况、TNM分期以及肿瘤位置进行了进一步的分层分析。结果发现在性别分层中存在层间差异（男性vs.女性,HR=0.70 vs.HR=0.56,P异质性=0.038）,再将女性患者按照是否绝经分为两组,我们发现与绝经后女性相比,在绝经前的女性中其25-OHD的保护效应更加明显（HR=0.12 vs.HR=0.72,P异质性=0.009）。同时我们还发现,在这部分均使用以氟尿嘧啶类药物为基础一线化疗方案的558例Ⅰ-Ⅲ期胃癌患者中,其血浆25-OHD浓度与患者化疗后骨髓抑制程度明显相关（调整前,β=-0.013,P=0.001;调整后,β=-0.012,P=0.003）。接着我们又研究了 Ⅰ-Ⅳ期胃癌患者血浆25-OHD浓度与病人总生存期之间的关系。在785例样本中,通过单因素/多因素Cox 比例风险回归模型,我们发现血浆25-OHD浓度亦与胃癌患者的OS显著相关。在这部分样本中,我们将患者按照血浆25-OHD浓度高低的三分位数等分为三组,与最低浓度组T1（25-OHD 浓度<36.66nmol/L）相比,最高浓度组 T3（25-OHD 浓度>48.93 nmol/L）的OS明显好于最低浓度组（调整前HR=0.48,P=3.34×10-6;调整后HR=0.41,P=1.28 ×10-7）。同样,我们通过基线资料进行了分层分析发现,在性别组中也存在着层间差异（T3vs.T1,男性vs.女性,HR=0.52 vs.HR=0.20,P异质性=0.030）,其中绝经前女性其血浆25-OHD的保护效应更强（P异质性<0.05）。综上所述,本研究基于较大样本量的人群数据,在流行病学预后研究的基础上,检测了胃癌患者的个体血浆25-OHD浓度,通过无进展生存期PFS和总生存OS这两个常用的预后判断指标证实:较高浓度血浆25-OHD的胃癌患者其预后较好,其中绝经前女性的血浆25-OHD的保护效应更强;另外,在Ⅰ-Ⅲ期的胃癌患者中,血浆25-OHD浓度与患者使用氟尿嘧啶类药物化疗后的骨髓抑制程度相关,较高浓度的25-OHD胃癌患者不易出现较重的骨髓抑制。本研究的结果为后续基因层面上的深入研究提供了支持。第三部分 维生素D代谢通路VDR/RXRA基因多态性与胃癌预后的关联研究在第二部分的研究中,我们证实胃癌患者的血浆25-OHD浓度与其预后相关。为了获得遗传学上的进一步证据,我们在第三部分研究中探索了维生素D代谢通路相关基因VDR/RXRA基因多态性与胃癌患者预后的关系。因为在人体维生素D代谢中,VDR/RXRA蛋白结合所形成的异二聚体在激活25-OHD的生物学效应中起重要作用,因此,我们检测了VDR/RXRA两个基因上共12个潜在的功能性单核苷酸多态性（SNP）位点的基因分型,将其结果纳入单因素及多因素的Cox 比例风险回归模型中,进而判断这些SNP位点是否与胃癌预后相关,同时,我们通过生物信息学分析,预测了阳性位点可能结合的microRNA。首先,在检测的12个SNPs中,我们通过Cox 比例风险回归模型计算,发现有4 个 SNPs（VDR基因上的 rs2228570 和 rs3847987;RXRA基因上的 rs4240711和rs1045570）与胃癌患者预后显著相关,在经过多重比较矫正后（P<0.05/12）,上述4个SNPs仍与胃癌患者预后显著相关。其调整后具体结果如下:rs2228570,HR=1.81,P趋势=6.28×10-4;rs3 847987,HR=1.75,P 趋势=0.009;rs4240711,HR=2.03,P 趋势=0.004;rs1045570,HR=2.03,P趋势=0.003。四个阳性位点的联合分析结果显示,在调整后的结果中,与携带0～1个危险等位基因的个体相比,携带2个及3～6个风险等位基因个体的死亡风险分别增加了 48%（HR=1.48,P=0.04）以及 118%（HR=2.18,P=6.67×10-6）。接着,我们在分析胃癌患者生存与SNP的基因-环境交互作用时发现,rs1045570位点存在边缘阳性的结果（P交互=0.09）,通过进一步的肿瘤位置分层分析发现,只有位于贲门/胃底的胃癌患者存在这样一种显著的交互作用（P交互=0.03）。综上所述,本研究为第二部分所发现的血浆25-OHD浓度与胃癌患者预后（PFS/OS）相关的这一结果提供了可能的遗传学证据:在VDR/RXRA基因上有4个SNPs位点与胃癌预后显著相关。本研究结果进一步证实:25-OHD在罹患胃癌的人群中起到一定的保护作用。本研究结果为在临床上考虑胃癌患者是否需要补充一定的维生素D以辅助抗肿瘤治疗以及何种亚组人群更适于维生素D辅助抗肿瘤治疗提供了相应的理论依据。