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白蛋白(albumin,ALB)是一种血清蛋白,仅在肝脏中表达,占肝脏新合成蛋白的5%～10%。本研究前期发现,白蛋白基因与雏鸭肝炎病密切相关,可作为雏鸭肝炎病的抗性标志基因,其表达具有肝组织特异性。目前国外学者对ALB基因的研究主要集中在:ALB基因与疾病关联性研究,及以鼠或人为试验模型对ALB基因的高效特异性表达机制的研究,技术成熟,并广泛地运用到转基因动物中。而在家禽上对该基因研究甚少,尤其是缺乏对其转录调控水平的研究。本论文为探究ALB基因特异性表达的分子机制,开展了对该基因转录调控机制的研究。本试验首先鉴定了ALB基因启动子在不同细胞系中转录活性,同时使用体外转录系统初步确定其核心启动子区及肝脏特异性表达的重要转录调控元件。1鸭ALB基因启动子在不同细胞系中的表达活性分析为探究ALB基因在肝组织和细胞中高效特异性表达的分子机制,本研究首先采用高特异性的启动子预测软件对前期获得的ALB基因启动子进行了分析预测,经综合分析初步锁定ALB基因启动子区位于其转录起始位点上游-1000bp附近,因此选择了-1037～+42bp(+1为转录起始位点)片段。以前期基因组步移获得的启动子序列为模板,扩增出该片段,用它替换pEGFP-N1载体的CMV启动子,成功构建了增强型绿色荧光蛋白载体 pALB-EGFP。在Lipofectamine 介导下将 pALB-EGFP、pEGFP-N1、pEGFP-N1-CVM-(去除完整的CMV启动子)分别转染到鸡胚肝细胞(CEL)、大鼠肝细胞(BRL-3A)、鸡胚成纤维细胞(DF-1)、小鼠精原细胞(GC-1)、人胚肾上皮细胞(293T)中,利用倒置荧光显微镜对各转染细胞中GFP的表达情况进行检测。结果发现pEGFP-N1瞬时转染上述5种细胞,在转染24h后均检测到明显的绿色荧光,其后荧光强度并未减弱;将pEGFP-N1/CVM-转染细胞后,未检测到GFP的表达;pALB-EGFP瞬时转染DF-1、GC-1、293T细胞系,镜下可见少量的GFP表达,但在转染CEL、BRL-3A24h后可见明显绿色荧光,并持续至转染后72h。试验结果初步表明ALB启动子只在肝脏来源的细胞中有起始转录活性,且没有种属特异性。2针对启动子区-1037bp～+42bp,以荧光素酶报告基因为载体构建6个ALB启动子缺失体,确定其核心启动子区。为了进一步定位其核心启动子区,以鸭基因组DNA为模板,分别在5’端缺失部分序列,共构建了 6个缺失突变体,M1(pGL3-Enhancer-1037bp/+42bp)、M2(pGL3-Enhancer-581bp/+42bp)、M3(pGL3-Enhancer-450bp/+42bp)、M4(pGL3-Enhancer-190bp/+42bp)、M5(pGL3-Enhancer-70bp/+42bp)和 M6(pGL3-Enhancer-51bp/+42bp)。结果表明,这6个缺失体在CEL和BRL-3A细胞系中均含不同程度的启动活性,但趋势一致,再次证明白蛋白启动子无种属特异性。所有缺失体活性与pGL3-Control进行比较,均表现为M6活性最低;M4活性较高,与M2、M3活性无显著差异,但显著高于M5和M1;M1、M5活性约为pGL3-Control的60%。表明ALB启动子-190bp～+42bp区为转录核心区域,-70bp～-51bp之间存在重要的调控元件,对启动子活性具有重要影响,-1037bp～-581bp之间可能存在负调控元件。3利用定点突变技术分析启动子核心转录区的重要调控元件经生物信息学分析预测,发现在启动子-70bp～-51bp区内存在HNF-1(hepatocyte nuclear factor-1)、C/EBPα(CCAAT/Enhancer binding protein)2 个肝脏富含的重要转录因子结合位点。在哺乳动物上,已证实HNF-1和C/EBPα结合位点对ALB基因的启动子的转录具有重要的调控作用。本研究先对这2个位点分别进行点突变,再同时突变。M4载体活性与M5差异显著,预测发现-190～-70bp区段内排列着3个核蛋白因子结合位点,依次为 HNF-3β(hepatocyte nuclear Factor-3p)、NF1(nuclear factor1)和C/EBPα,分别对它们进行点突变。将上述载体先后转染CEL细胞,探究各位点突变对启动子转录活性的影响,结果表明位点NF1、HNF-3β在该序列上可能无激活能力,而HNF-1和C/EBPα对ALB基因启动子的转录有调控作用,且HNF-1对启动子的活化作用更强。