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迄今为止,越来越多的证据表明,microRNA的表达失调和甲状腺癌等多种危害较大的肿瘤的发生、发展和转移密切相关。据多个研究报道,microRNA家族成员之一的miR-338-3p参与了非小细胞肺癌和神经胶质瘤等多种恶性肿瘤的发生过程。但是miR-338-3p是否也参与甲状腺癌的发生、发展和转移以及其参与调节的具体机制还远未阐明。本研究运用分子生物学、细胞生物学和动物学等实验技术来研究miR-338-3p在甲状腺乳头状癌发生、发展及侵袭转移中的作用,实验结果分以下六部分。1在甲状腺乳头状癌组织和甲状腺乳头状癌细胞系中miR-338-3p的表达显著下调。荧光实时定量PCR(qRT-PCR)结果显示,与癌旁的正常组织(adjacent noncancerous tissues,ANT)相比,miR-338-3p在甲状腺肿瘤组织中的表达明显下调,有统计学差异,p<0.01,上述实验结果提示miR-338-3p参与了甲状腺肿瘤的发生过程。同时,我们的结果提示miR-338-3p的表达水平与甲状腺肿瘤的TNM分期相关明显,甲状腺肿瘤分期越高,miR-338-3p的表达值越低。另外,在甲状腺肿瘤发生转移的13例患者中,有12例患者miR-338-3p的表达值低于0.34,仅有1例患者的miR-338-3p的表达值高于0.34,有统计学差异,p<0.01,提示miR-338-3p的表达水平高低和甲状腺乳头状癌是否发生转移密切相关。qRT-PCR结果显示,与正常人甲状滤泡上皮细胞(Nthy-ori3-1)相比,miR-338-3p在三种不同的甲状腺肿瘤细胞系(8505C,TPC-1和SW1736)的相对表达值明显下降,有统计学差异,p<0.01,而miR-338-3p在三种甲状腺肿瘤细胞系中的相对表达值没有差异。2体内和体外实验证实miR-338-3p可以抑制甲状腺乳头状癌的生长。qRT-PCR结果显示,与转染对照miR-NC组相比,TPC-1细胞转染miR-338-3p类似物后,TPC-1细胞内miR-338-3p的表达明显上调,并有统计学差异,p<0.01。其次,MTT实验结果提示,与转染对照miR-NC组相比,TPC-1细胞转染miR-338-3p后,细胞的活化和增殖能力明显减弱,即细胞活力变弱,并有统计学差异,p<0.01。另外通过细胞计数发现,与转染对照miR-NC组相比,TPC-1细胞转染miR-338-3p后,TPC-1细胞克隆形成能力明显显著下降,并有统计学差异,p<0.01。最后,我们在TPC-1细胞中过表达miR-338-3p,然后将过表达miR-338-3p的细胞移植到小鼠体内,构建过表达miR-338-3p的TPC-1甲状腺乳头状癌细胞移植瘤模型,然后通过不同时间点观察小鼠体内移植瘤的大小并在体评估过表达miR-338-3p对甲状腺肿瘤发生发展的影响,小鼠移植瘤实验结果提示,与移植正常TPC-1细胞相比,移植过表达miR-338-3p的TPC-1细胞后,小鼠体内移植瘤明显变小,移植瘤重量明显减轻,并有统计学差异,p<0.01。3 miR-338-3p可以抑制甲状腺乳头状癌的侵袭和转移。TPC-1甲状腺乳头状癌细胞的划伤模型实验结果证实,与对照miR-NC相比,在TPC-1细胞中过表达miR-338-3p可以明显抑制TPC-1细胞的迁移,并有统计学差异p<0.01;同时,Transwell实验结果证实,与对照miR-NC相比,在TPC-1甲状腺乳头状癌细胞中过表达miR-338-3p发现可以明显抑制细胞的侵袭能力,并有统计学差异,p<0.01。4 AKT3是miR-338-3p的调控靶点。我们通过miRannda,Target Scan和Pic Tar生物数据库分析并预测和miR-338-3p结合的靶基因,并且通过文献比对和分析证实,AKT3的3’端非翻译区内有miR-338-3p的直接结合的种子序列,二者的序列高度互补,即AKT3很有可能是miR-338-3p的调控靶点。荧光素酶报告系统实验证实,与过表达突变位点的AKT3质粒组相比,过表达AKT3质粒后荧光素荧光活性明显降低,并有统计学差异,p<0.01,即miR-338-3p可以和AKT3直接结合。我们的研究进一步证实,与转染miR-NC组不同,转染miR-338-3p后可以明显抑制TPC-1细胞内AKT3的m RNA表达,并有统计学差异,p<0.01;同时,Western blot实验从蛋白水平证实,与转染miR-NC组相比,TPC-1甲状腺乳头状癌细胞转染miR-338-3p后,可以明显抑制TPC-1细胞中AKT3的蛋白表达,并有统计学差异,p<0.01。最后,我们分别检测了48例患者中AKT3的表达情况,qRT-PCR结果显示,与ANT相比,AKT在甲状腺肿瘤组织中的表达明显上调,有统计学差异,p<0.01;而且48例患者肿瘤组织中的AKT表达值和miR-338-3p表达值呈明显负相关,相关系数为r=-0.614,p<0.0001,上述实验结果提示作为miR-338-3p的调控靶点AKT3参与了甲状腺肿瘤的发生过程。5 AKT3可以促进甲状腺乳头状癌的发生发展。我们的研究证实与转入si-NC对照组相比,转入si-AKT后,可以从转录和翻译水平明显抑制AKT3的表达,有统计学差异,p<0.01。而且我们的研究证实,抑制AKT3的表达后,可以明显抑制TPC-1细胞的增殖和克隆能力,并有统计学差异,p<0.01。最后,我们证实,与对照组相比(si-NC),抑制AKT3的表达后,可以明显抑制TPC-1细胞的侵袭和迁移能力,并有统计学差异,p<0.01。6 AKT3可以部分逆转miR-338-3p对甲状腺乳头状癌的抑制作用。我们的研究结果证实,与对照组相比,转入AKT3质粒后可以明显逆转miR-338-3p对AKT3的抑制作用,有统计学差异,p<0.01;其次,过表达AKT3可以逆转miR-338-3p对TPC-1细胞的增殖和克隆能力的抑制作用,并有统计学差异,p<0.01;最后,我们证实过表达AKT3可以逆转过表达miR-338-3p对TPC-1甲状腺乳头状癌细胞侵袭和迁移能力的抑制作用,并有统计学差异,p<0.01。结论与创新点本研究通过体内体外实验系统阐明miR-338-3p在甲状腺乳头状癌发生发展中的变化特点以及发挥作用的机制,即miR-338-3p可以抑制AKT3的蛋白表达进而抑制TPC-1细胞的增殖,克隆以及TPC-1细胞的侵袭和迁移。本研究明确证实,甲状腺乳头状癌组织中miR-338-3p的表达水平变化可以实时反应甲状腺乳头状癌是否发生、组织学分期以及是否发生转移,所以miR-338-3p可以作为临床筛查和判断甲状腺乳头状癌分期和是否发生转移的生物学标记物;而且我们还通过在体实验证实,在甲状腺乳头状癌中上调miR-338-3p或者下调AKT3的表达可以明显抑制甲状腺乳头状癌的发生和发展,进一步完善了甲状腺乳头状癌中microRNA的调控网络,所以我们的研究为临床治疗甲状腺乳头状癌提供药物靶点和理论及实验支持。