作为女性最为常见的恶性肿瘤之一,乳腺癌发病率逐年上升。鉴于乳腺癌现在已成为威胁女性身心健康的常见疾病,随着人们对乳腺癌的认识加深与生活质量的提高,其预防工作已成为该领域的研究重点和热点。正常乳腺导管上皮细胞转化为癌细胞是一个多阶段、多步骤的过程,目前多数学者认为,乳腺癌的发生经历正常上皮(normal epithelium)→普通增生(usual ductal hyperplasia, UDH)→非典型增生(atypical ductal hyperplasia, ADH)→原位癌(carcinoma in situ, CIS)→浸润性癌(invasive breast cancer, IBC)的连续变化过程,此过程易受基因表达、慢性疾病等多种因素的影响。鉴于目前认为在癌前病变及其之前阶段的过程是可以逆转的,因此,复制这一连续变化过程、明确其病理变化、了解其发生机制,对于寻找有效干预措施,及时预防,是控制乳腺癌最行之有效的途径。在研究过程中,依靠临床患者标本搜集,无法获得同一个体具有该连续性病理变化过程的一系列标本；而动物模型不仅简单方便、容易操作,而且可以最大程度的模拟患者病理生理状态下的内环境,从而为实现这一目标提供有力工具。目前动物肿瘤模型建立方法可分为自发型、可移植型和诱发型。相比其他方法,诱发模型利用致癌因素与实验动物直接或间接接触,可以保证在原始生理状态、解剖特征的前提下,最大程度的模拟疾病发生发展的内环境,重现乳腺癌发生进展的完整过程。目前乳腺癌动物模型以及乳腺增生相关动物模型都已经比较成熟,但乳腺癌前病变动物模型因实验终点难以准确把握,导致模型成功率过低,所以乳腺癌前病变动物模型国内外鲜有成功报道。目前国内外公认的乳腺癌高危因素包括月经初潮早、绝经晚、行经时间过长等。临床中,三苯氧胺和芳香化酶抑制剂作为乳腺癌内分泌治疗药物也已经广泛推广应用。这说明雌激素在乳腺癌发生发展中,起到至关重要的作用。但雌激素在体内如何致癌,其具体分子机制在动物模型中是否和人体内相似,目前仍没有明确统一的认识。本研究采用28日龄雌性SD大鼠,以二甲基苯葸(7,12-dimethylbenz-1,2-ben zanthracene, DMBA)灌胃(15mg/kg,第1、55、96天分别给药)联合雌激素(0.5mg/kg/d)+孕激素(4 mg/kg/d)序贯给药(每5天为一给药周期)的方法,应用视诊、触诊大体形态学观察,辅以超声、磁共振影像学检查,同时结合最终病理学诊断来判定癌前病变实验终点,成功建立了乳腺癌前病变模型。在此基础上,我们应用酶联免疫吸附实验和免疫组织化学技术,检测此模型癌变过程中正常乳腺组织、癌前病变组织和乳腺癌组织中2-羟雌二醇(2-hydroxyl-estradiol,2-OH-E2)、4-羟雌二醇(4-hydroxyl-estradiol,4-OH-E2)、16a-羟雌酮(16a-hydroxyl-estrone,16a-OH-E1)、雌激素受体a (estrogen receptora、ERα)、雌激素受体β(estrogen receptorβ, ERβ)及磷脂酰肌醇3激酶-85a (phosphatidylinositol-3-ki nases-85a, PI3K-85a)的表达,探讨此模型中雌激素致癌机制,进一步评价本模型的实用价值。第一部分 乳腺癌前病变大鼠模型的建立与评价研究背景：乳腺癌的发展从UDH到ADH再到CIS,最终发展为IBC,是一系列连续步骤,这些病变可以共存于同一个体的乳腺组织中。Shaaban等通过流行病学研究发现,若不施加任何干预措施,UDH、ADH、DCIS最终发展为IBC的相对危险性(relative risk, RR)分别为1.5-2、4-5和8-10。ADH和DCIS属于IBC的前期病变,称之为癌前病变。癌前病变作为乳腺癌发展中的重要环节,是一个相对较为漫长的过程。研究显示,在此阶段施加干预措施,能够阻止甚至完全逆转乳腺癌的发生。乳腺癌前病变动物模型的建立,能最大程度的模拟人体复杂的病理生理状态,为探讨乳腺癌发病原因和机制及二级预防提供实验平台。早在1961年,Huggins等研究发现,DMBA和N-甲基-N-亚硝基尿(N-met hyl-N-nitrosourea, MNU)均可作为致癌剂特异性使大鼠乳腺成瘤。乳腺作为激素敏感性器官,雌孕激素周期性作用于乳腺,可使腺体增生和复旧规律出现,雌孕激素水平的升高,不仅可以提高肿瘤的发生率,而且可以使肿瘤的发生提前。因此我们推测,应用乳腺特异性致癌剂MNU或DMBA联合雌孕激素、控制合理的药物剂量及给药周期,可能会出现窗口期较长的乳腺癌前病变阶段。癌前病变动物模型建立的瓶颈在于对病变终点的确定。作为肿瘤诊断的金标准,病理学检查虽然能够准确判断肿物性质,但应用此方法的缺点是必须将动物处死或者麻醉后切取部分可疑病变组织进行病例评价,会在一定程度上中断疾病自然演进过程。在整个动物模型的建立过程中,其应用受到一定限制。因此,亟需形成一套简单易行、合理方便的指标,实现在无创的条件下确定癌前病变终点的目的。超声检查具有时效性、便捷性、无创性和经济性,可以短期内多次反复进行观察,目前已经广泛应用于临床乳腺良恶性肿瘤的判别及辅助诊断。二维超声作为目前乳腺疾病最常用的辅助检查技术,能够较为清晰的显示恶性肿瘤特征如：肿块形态不规则、毛刺征、钙化、纵横比、后方回声衰减和侧方声影等。乳腺磁共振成像技术(Magnetic Resonance Imaging, MRI)因其良好的软组织分辨率、无创性、无辐射以及多方位、多参数、多序列成像,以及其不易受乳腺软组织密度影响的特点,成为乳腺疾病辅助检查的重要方法。MRI包括平扫、动态增强成像和弥散加权成像等多种成像方式：平扫仅通过信号强度的不同以及形态学表现对乳腺疾病进行诊断；动态增强扫描是通过注射显影剂,更清楚的显示病变部位及其周围形态学特性以及血流动力学相关信息；多期扫描后,绘制动态增强曲线,对乳腺肿瘤性质的鉴别诊断具有重大辅助作用。综上所述,我们认为,目前国内外在对于乳腺癌前病变大鼠模型的研究较少且尚无有效的建模评价指标。因此,本研究拟在建立乳腺癌前病变的基础上,参照相应临床指标,结合本实验具体情况,从大体形态、影像学和病理学三方面进行比较评价。研究目的：本研究分别从致癌剂的种类、致癌剂和雌孕激素给药途径、剂量、周期方面,分4次动物实验依次进行,以此探讨能够延长癌前病变窗口期、与人体内环境最为接近的诱发型乳腺癌前病变大鼠模型的最佳方法,为乳腺癌的预防提供动物平台。在建模过程中,引入超声、MRI影像学检测,结合大体形态学观察,参考最终病理学诊断金标准,评价并确定乳腺癌前病变动物模型终点的指标。研究方法及结果：一.建立乳腺癌前病变大鼠模型。通过4次动物实验,分别确定致癌剂的种类、联合雌孕激素给药途径、剂量及给药周期。1.实验一：致癌剂DMBA和MNU的选择。随机将SD大鼠分成七组,分别进行如下干预：一组,6只,空白对照组；二组,12只,DMBA100mg/kg一次性灌胃；三组,10只,DMBA100mg/kg一次性灌胃+雌孕激素5天一周期；四组,12只,DMBA100mg/kg一次性灌胃+雌孕激素30天一周期；五组,10只,MNU50mg/kg一次性灌胃；六组,10只,MNU50mg/kg一次性灌胃+雌孕激素5天一周期；七组,10只,MNU50mg/kg一次性灌胃+雌孕激素30天一周期。结果：实验终点前,因致癌剂毒性所致总死亡率DMBA各组(二、三、四组)为38.23%,MNU各组(五、六、七组)为43.33%；实验开始后第120～180天之间,DMBA各组发现癌前病变的大鼠分别为二组5只(62.50%)、三组3只(50.00%)、四组4只(57.00%)；至实验终点,DMBA各组所有存活大鼠均出现IBC且集中出现在第150～200天。MNU各组,除第七组发现一只大鼠出现癌前病变外,其余各组均未发现癌前病变。MNU各组最终出现IBC的大鼠数目分别为4、5、5只。MNU组癌前病变检出率低、死亡率高,可能与其毒性更强,使得癌前病变窗口期窄,不易被检出有关。据此在后续的研究中,我们选择DMBA作为癌前病变诱导剂。2.实验二：致癌剂DMBA给药方式—灌胃或腹腔注射的选择。随机将SD大鼠分成六组,每组5只,分别进行如下干预：一组,DMBA60mg/kg一次性腹腔注射+雌孕激素5天一周期；二组,DMBA50mg/kg一次性腹腔注射+雌孕激素5天一周期；三组,DMBA100mg/kg一次性灌胃+雌孕激素5天一周期；四组,DMBA60mg/kg一次性灌胃+雌孕激素5天一周期；五组,DMBA50mg/kg一次性灌胃+雌孕激素5天一周期；六组,DMBA40mg/kg一次性灌胃+雌孕激素5天一周期。结果：DMBA腹腔注射实验组在19天内10只大鼠均死亡,尸检发现大量淡血性腹水,肝、肾体积增大,经病理证实存在肝、肾部分急性坏死。相比之下,灌胃给药各组死亡率较低,但因每组大鼠基数较少,各组间无明显统计学差异。因此我们认为DMBA腹腔注射毒性大,致死率高,在后续实验过程中,均采用DMBA灌胃的给药方式。3.实验三：雌孕激素给药周期—5天或30天的选择。随机将SD大鼠分成四组,分别进行如下干预：一组,6只,对照组；二组,15只,DMBA100mg/kg一次性灌胃+雌孕激素序贯30天一周期；三组,15只,DMBA100mg/kg一次性灌胃+雌孕激素序贯5天一周期；四组,15只,单药DMBA100mg/kg一次性灌胃组。结果：本次实验中,我们增加了每组大鼠数量,DMBA单药、DMBA联合雌孕激素5天一周期、DMBA联合雌孕激素30天一周期进行对比,结果显示,DMBA联合雌孕激素5天一周期组癌前病变检出率(55.60%)高于二组(40.00%)和四组(37.50%),提示雌孕激素5天一周期有助于稳定大鼠乳腺癌前病变,延长窗口期。在本次实验中我们发现,致癌剂干预后30天内各组大鼠仍有较高的死亡率,二、三、四组分别有5(33.33%)、6(40.00%)、7(46.67)只大鼠死亡。4.实验四：致癌剂DMBA剂量和给药次数选择。50只大鼠随机分为5组,每组10只,本次实验采用低剂量分次给药的方式,致癌剂DMBA从10mg/kg到30mg/kg,每组递增5mg/kg,分别在实验开始的第1天、55天、96天三个时间点进行致癌剂干预。从第2天起,所有大鼠均按照5天为1周期进行雌孕激素干预。一组,DMBA10mg/kg;二组,DMBA15mg/kg;三组,DMBA20mg/kg;四组,DMBA25mg/kg;五组,DMBA30 mg/kg.结果：研究发现除30 mg/kg组大鼠有50%死亡率外,其余各组死亡率均低于20%。在致癌剂干预后第121～200天,共79天内,实验组各组大鼠共有19只(47.50%)首次发现癌前病变,其中以第二组最高,为7(87.50%)只,且首次出现癌前病变时间集中在121～181天的60天内。窗口期以第三组最长,为51天；其次是第二组,38天；第五组最短,为8天。二.建立大鼠乳腺癌前病变模型的评价指标。模型建立过程中自致癌剂干预后第二天起,每日逐一进行视诊、触诊,每周2次超声检查,发现肿物后,随即在全麻下行肿物切除(包括肿物及周围少量正常腺体)进行病理学诊断。若超声检查结果提示可疑病变,则行MRI进行辅助诊断,若发现可疑病变,亦在全麻下将可疑病变切除进行病理学诊断。致癌剂干预第200天,处死所有大鼠,留取乳腺组织对其可疑部位做病理学诊断。1.大体形态观察,包括视诊和触诊。视诊内容：腹部有无隆起、乳头及其周围皮肤颜色、乳头大小等；触诊内容：腹部皮下脂肪垫质地、有无肿物。发现肿物随即记录肿物大小、形状、质地、边界、活动度等。2.超声观察内容：肿物边界、界限、形态、内部回声、有无细点状强回声钙化灶、有无后方回声衰减、血流信号Adler半定量分级、内部动脉血流指数。3.MRI观察内容：普通扫描和增强扫描中,腹部皮下组织信号强度、有无异常强化、动态增强血流动力学曲线表现型等。4.病理学观察,所有组织切片均进行HE染色,无法明确诊断者,用免疫组织化学检测乳腺肌上皮分子标记物P63进行进一步诊断。结果：1.在大体形态上,癌前病变大鼠模型表现为乳腺皮肤红润、隆起,乳头增高增大；触诊可及皮下脂肪垫增厚、质软,肿物多呈不规则形、表面不光滑、边界不清。2.超声显示,癌前病变肿物边界多不规整,界限不清,形态不规则,可表现为凹凸不平或有角状凸起；内部回声较低；有时可见细点状强回声钙化灶；少部分有后方回声衰减；血流信号Adler半定量分级Ⅰ-Ⅱ级；内部动脉血流指数RI>0.7。磁共振T1WI上多呈低或中等信号；增强扫描中,可见异常强化,多为小斑点状强化灶或肿块强化灶、导管样或段样强化；动态增强血流动力学曲线表现为流出型或平台型。3.病理学观察,通过HE染色和P63免疫组化共同确诊,癌前病变分以下几种病理学类型：不典型导管增生(ADH)、导管原位癌(DCIS)、不典型小叶增生(ALH)、小叶原位癌(LCIS)。结论：1. DMBA较MNU毒性低,在乳腺癌前病变建模过程中,可提高大鼠出现癌前病变的机率。2.模型建立过程中,选择DMBA分次小剂量灌胃,可在保障造模效果的同时显著降低各实验组大鼠死亡率。3.雌孕激素刺激大鼠腹部皮下乳腺腺体增生,5天为一周期的给药方式与大鼠体内固有的生理周期(5天)相适应,可规律性出现增生复旧变化,创建了较为适宜的机体内环境,使建模过程中,乳腺癌前病变进程相对延长。4.超声表现为局部不均匀低回声、血流局灶性增强；动态增强MRI中时间-信号强度曲线表现为流出型或平台型,均可以作为癌前病变活体动态观测的参考指标。5. DMBA(15mg/kg第1天、55天、96天分别灌胃)联合雌激素(0.5mg/kg/d腹腔注射)+孕激素(4mg/kg/d腹腔注射)序贯给药(每5天为一给药周期)能成功建立较稳定的乳腺癌前病变动物模型。第二部分 乳腺癌前病变大鼠模型发生机制的初步研究研究背景：第一部分研究中,我们应用致癌剂DMBA联合雌孕激素5天一周期,成功建立了大鼠乳腺癌前病变模型,同时也发现与大鼠内在生理周期相同的5天一周期的雌孕激素干预,更适合建立癌前病变大鼠模型。相同剂量、同样给药方式的DMBA,不同雌孕激素干预周期(5天或30天一周期),最终出现癌前病变率不同。据此我们推测DMBA仅仅作为肿瘤发展中的始动因素,而体内雌孕激素的周期性变化,为肿瘤发生发展提供微环境,在某种程度上影响着肿瘤发生及生长速度。雌孕激素5天一周期序贯给药,与内源性激素协同作用于乳腺,促进乳腺导管及腺泡发育,有规律地促进乳腺腺体增生、复旧这一过程对组织的刺激作用,可能使之停滞在非典型增生期时间延长；本实验模型大鼠采用28日龄,此时大鼠内源性激素水平较低还未形成正常的生理周期,通过注入外源性激素(5天为一周期)帮助大鼠体内生殖系统和内分泌系统发育成熟,使外源性激素与大鼠内源性激素的分泌形成同步性作用,共同促进乳腺组织的增生发育,使乳腺较为同步地出现一般增生、非典型性增生、癌这一连续过程,从而有利于准确判断并控制实验终点。雌激素作为女性重要的内分泌激素,在生殖系统、运动系统以及心血管系统等方面发挥重要作用。迄今为止,尽管乳腺癌发病原因未形成明确统一认识,但目前证据明确证实,雌激素在乳腺癌发生发展中起正向推动作用。早在1998年10月,美国食品与药品管理局(Food and Drug Administration, FDA)就正式批准,雌激素拮抗剂他莫昔芬可以用于高危女性乳腺癌的预防；20世纪90年代初,以他莫昔芬为代表的乳腺癌内分泌化学预防实验逐步展开,十年随访数据表明,他莫昔芬能明显降低乳腺癌患者术后复发率和转移率。目前研究表明,雌激素在体内通过雌激素受体(Estrogen Receptor, ER)信号转导机制和雌激素代谢两种方式产生致癌作用。雌激素与其受体结合,致受体二聚化,与下游靶基因的雌激素反应元件结合,激活MAPK、PI3K、JNK等通路,刺激乳腺细胞不断增殖,增加了DNA复制过程中出现错误的机会,通过相关基因突变,导致乳腺癌的发生。其中,PI3K通路作为该模式中的经典通路,在诱导细胞分化、增殖、浸润和转移中发挥重要作用。在其代谢途径中,雌激素主要通过羟化反应,生成2-OH-E2和2-羟雌酮(2-hydroxyl-estrone,2-OH-E1)、 4-OH-E2和4-羟雌酮(4-hydroxyl-estrone,4-OH-E1), 16a-OH-E2和16α-羟雌酮(16a-hydroxyl-estrone,16a-OH-E1)。这些化合物中,4-OH-E2和16a-OH-E,且有致癌作用。而2-羟基可以在儿茶酚-o-甲基转移酶(catechol-O-methyl transfera se, COMT)的作用下,生成抗癌物2-甲氧雌酮和2-甲氧雌二醇。所以,2-羟基和16α-羟基、以及2-羟基和4-羟基的比例,决定着乳腺细胞的癌变过程,通过16α-羟基和4-羟基进行雌激素代谢比例高的,其乳腺癌发病风险高于通过2-羟基进行雌激素代谢比例高者。SD大鼠雌激素结构与人的极为相似,生理功能相同,结构上都分为A-F 6个区,各区的构成和功能与人类相同,所产生的乳腺肿瘤也以激素依赖性居多。因此,我们推测雌激素在大鼠体内可能也经历上述相似过程,导致了癌变的发生。本实验应用酶联免疫吸附实验(ELISA)和免疫组织化学技术,对已经成功建立的大鼠乳腺癌前病变模型中正常乳腺组织、癌前病变组织和乳腺癌组织中雌激素作用通路关键指标进行检测比较分析,探讨该模型中雌激素作用机制,评价其实用价值。研究目的：在已经成功建立乳腺癌前病变大鼠模型的基础上,初步探讨雌激素在其模型中的作用机制。研究方法：1.采用ELISA实验技术检测模型中正常乳腺组织、癌前病变及乳腺癌组织中2-OH-E2、4-OH-E2和16a-OH-E1的水平。2.应用免疫组化技术检测ERα、ERβ及PI3K-P85a在正常乳腺组织、癌前病变及乳腺癌组织中的表达情况。3.数据处理：应用SPSS20.0进行统计分析。ELISA数据应用MasterPlexReaderFit专业软件进行分析处理。研究结果：1.2-OH-E2、4-OH-E2和16a-OH-E1含量在大鼠正常乳腺组织、癌前病变及乳腺癌组织中均逐步升高,尤其以4-OH-E2和16a-OH-E,含量增高更为明显(P<0.001)。2.4-OH-E2与2-OH-E2的比值在大鼠乳腺癌前病变组织中最高,且与正常组织、乳腺癌组织中的比值有统计学差异(P值分别为0.002和0.030)。3.16a-OH-E1与2-OH-E2的比值在大鼠正常乳腺组织、癌前病变及乳腺癌组织中均逐步升高,但仅在正常乳腺组织、癌前病变组织与乳腺癌组织中比值变化有统计学差异(P<0.001)。4.ERa在大鼠正常乳腺组织、癌前病变及乳腺癌组织中表达范围及总评分逐步增高,正常乳腺组织到乳腺癌前病变的差异最为显著(范围得分：P<0.001；总评分：P=0.003),而乳腺癌前病变到乳腺癌无明显差异。表达强度在各组间无明显差异。5.ERp在大鼠正常乳腺组织、癌前病变及乳腺癌组织中表达范围逐步降低,正常乳腺组织与乳腺癌前病变组织差异有统计学意义(P=0.008),强度无明显统计学差异,总评分中,正常乳腺组织与乳腺癌两组间有统计学差异(P=0.006)。6. PI3K-P85a在大鼠正常乳腺组织、癌前病变及乳腺癌组织中表达范围、强度均逐步增大,范围、强度及总评分在各组间均有统计学差异(P值均<0.001)。结论：1.乳腺癌前病变大鼠模型中,雌激素主要通过4-OH-E2和16a-OH-E1途径进行代谢。2.乳腺癌前病变大鼠模型中,雌激素主要与雌激素受体途径的ERa结合,启动下游雌激素受体元件,并且使PI3K-P85a表达上调。3.4-OH-E2与2-OH-E2的比值以及ERa表达水平在大鼠正常乳腺组织到乳腺癌前病变组织中的变化特异,可作为乳腺肿瘤诊断的辅助指标。4.人与大鼠雌激素致癌途径基本相似,此模型最大程度的模拟人体内环境致癌过程,具有较高的使用价值。