研究背景类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是以关节和关节周围组织非化脓性炎症为主的一种慢性自身免疫系统疾病,以关节滑膜炎为特征,呈现进行性发展,在导致患者的受损关节畸形及功能障碍的同时,还易引发各种并发症,严重影响患者的身心健康和生活质量。近年来的流行病学资料提示:与普通人群相比,心血管疾病,尤其冠心病(coronary heart disease,CHD)在RA患者中的发生率明显升高,增加近50%～60%。对于病史超过10年的RA患者心肌梗死发病率增加3.1倍,提示CHD可能是RA的严重并发症之一。RA是心血管疾病的一种独立危险因素,然而长期以来,RA并发CHD尚未引起临床足够重视,RA患者的寿命明显缩短。有关RA和心血管疾病之间确切的发病机制仍不清楚,需要更多的医学研究来提高我们对这方面问题的认识。增强对RA患者并发心血管疾病的警惕,及早对RA患者进行心血管疾病的筛查,降低其心血管疾病发生率,提高RA患者生存周期,已成为一项重要课题,需要进一步探索研究。寻求一种血浆标志物能够准确有效地预测和及早发现RA患者的CHD发生风险,在预防RA并发CHD的发生、发展方面,具有重要的临床价值和现实意义。circRNA是一类由mRNA 3’和5’末端首尾相连形成的无蛋白编码功能的RNA分子,主要由前体RNA(pre-mRNA)通过可变剪切加工产生,circRNA广泛存在于所有真核生物中,并且非常稳定,其主要有3个功能,包括:充当miRNA“海绵”(circRNA通过吸附miRNA来抑制其功能)、调节转录或剪接、与RNA结合蛋白相互作用。最新的研究表明circRNA在疾病的发生和发展过程中发挥着十分重要的作用,其具有独特的闭合环状结构,使得其对核酸酶不敏感,比线性RNA更为稳定,在人类疾病可作为新的潜在介质和临床诊断标志物。circRNA通过直接或间接影响miRNA表达,导致mRNA和蛋白质表达失调,也可以直接影响蛋白质表达。一些研究显示:circRNA在肿瘤、糖尿病、神经系统疾病、自身免疫性疾病和动脉粥样硬化等疾病的发生过程中起到非常重要的作用。利用基因芯片技术,对来自不同细胞系和组织中的circ RNA表达谱数据进行聚类分析,能够鉴定出在一些特定组织和细胞中特异性表达的circRNA。目前,科学家们己成功将circ RNA芯片应用于肺组织、大脑组织、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、细胞等的研究,找到相应circRNA特异性表达,并且circRNA在监测癌症手术后的复发方面己取得一些成果。因此,circRNA的表达变化与许多疾病的发生、发展密切相关,可能成为多种疾病无创诊断的高特异性和高敏感性标志物。目的1.采用circRNA基因芯片技术分析RA合并CHD患者与单纯RA、单纯CHD和健康对照者血浆中差异表达的circRNA;2.探索血浆差异性表达circRNA作为RA合并CHD临床诊断标志物的可行性和应用价值。材料和方法第一部分血浆circRNAs在RA并发CHD组与各对照组间表达差异的筛查1.1 研究对象选取2016年6月-2016年8月玉溪市人民医院住院RA合并CHD患者3例为研究组,同时匹配同期住院的年龄、性别和例数设立单纯RA组、单纯CHD组和健康对照组。CHD的诊断采用1979年国际心脏病学会和协会及世界卫生组织临床命名标准化联合专业组的报告标准,RA的诊断采用2010年美国风湿协会RA的诊断标准。清晨采集受试者空腹静脉血10ml于EDTA-K3抗凝管内,3500r/min离心15分钟,血浆分装至2ml冷冻管保存于-70℃冰箱备用。1.2 方法采用高通量circRNA芯片技术筛选RA合并CHD患者、单纯RA患者、单纯CHD和健康人群各3例血浆中circRNA表达谱差异,经过对原始数据进行预处理,筛选出差异表达的circRNA,并对其进行聚类分析。1.3 基因芯片分析采用Axon基因芯片4000B芯片扫描仪扫描各个标本Cy3荧光强度,之后使用安捷伦扫描仪G2505C将图像扫描输入Agilent Feature Extraction 11.0 Software进行图像数据分析。采用R软件包对数据进行归一化处理。层次聚类进行样品之间的circRNAs表达模式区分。两组样本间差异表达的circRNA经变化倍数和P值进行筛选,选取变化倍数>1.5倍,t检验以P值<0.05为具有统计学意义。依据芯片筛选出差异表达的circRNA绘制火山图和散点图,并对所得数据进行层次聚类分析。每个circRNA均采用美国Arraystar公司miRNA结合位点软件,预测与相关circRNA有关系的可能性最大的前5个miRNA。第二部分血浆circRNAs在RA并发CHD组与对照组间表达差异的初步验证2.1 研究对象选取2016年6月-2017年4月玉溪市人民医院住院RA合并CHD患者10例为研究组,同时匹配同期住院的年龄、性别和例数设立单纯RA组、单纯CHD组和健康对照组。研究对象入选及排除标准、标本的采集及处理同1.1。2.2 方法依据基因芯片技术所分析的RA合并CHD患者与单纯RA、单纯CHD和健康对照者血浆中差异表达的circRNA,挑选出五个上调或下调circRNA基因(circR-0089762:与单纯RA比较下调10.53倍、circR-0077462:与健康对照比较下调2.23倍、circR-0081545:与健康对照比较上调2.05倍、circR-0004121:与健康对照比较上调2.96倍、circR-0044837:与单纯CHD比较下调11.25倍)进行荧光定量PCR检测。2.3 统计学方法荧光定量结果采用2(-ΔCt)法计算不同组织间基因表达的变化。统计学分析用平均数±标准差方式。四组间样本的比较采用单因素方差分析Oneway-ANOVA,组间qPCR结果差异倍数采用DPS数据分析系统(V14.10高级版)Tukey法分析,以P<0.05为具有统计学意义。第三部分血浆circRNAs在RA并发CHD组与对照组间表达差异的进一步验证及临床应用研究3.1 研究对象选取2016年6月一2017年6月玉溪市人民医院住院RA合并CHD患者30例为研究组,同时匹配同期住院的年龄、性别和例数以同期住院RA组、单纯CHD组和健康对照组。研究对象入选及排除标准、标本的采集及处理同1.1。3.2 方法第二部分实验对5个挑选出来的circRNA采用q-PCR进行检测,经统计分析circR-0089762比较健康组、单纯RA组和单纯CHD组表达均有统计学意义(P<0.05,Fold chang 分别为 4.32、0.36 和 3.57);circR-0004121 和其他三组对比表达均有统计学意义(P<0.05,Fold chang分别为8.60、22.94和45.45),挑选出这两个(circR-0089762下调、circR-0004121上调)基因在这一部分进行进一步的q-PCR检测验证,并结合临床指标进行分析。3.3统计学方法荧光定量结果用2(-ΔCt)法计算不同组间基因表达的变化。统计学分析用平均数±标准差方式。以spss22.0和DPS数据分析系统(V14.10高级版)进行统计分析,非参数Mann-Whitney检验用于比较RA并发CHD与其他三组之间circRNA的差异表达,组间qPCR结果差异倍数采用DPS数据分析系统(V14.10高级版)Tukey法分析,以P<0.05为具有统计学意义。采用ROC曲线下面积评估诊断指标的精确性,采用Pearson单因素相关分析,分析circRNA的表达水平和一些临床指标之间的相关性,评价常规心血管疾病诊断指标、表达差异的circRNA单一和联合在诊断RA并发CHD中的可行性和应用价值。结果第一部分血浆circRNAs在RA并发CHD组与各对照组间表达差异的筛查通过芯片分析,主要分析RA合并CHD患者与健康人群、单纯RA、单纯CHD血浆中差异表达circRNA,筛选出表达差异倍数大于1.5倍以上,且具有统计学意义的circRNA:RA合并CHD组与健康人群组232个;RA合并CHD组与单纯RA组95个;RA合并CHD组与单纯CHD组473个。第二部分血浆circRNAs在RA并发CHD组与对照组间表达差异的初步验证由基因组circRNA表达检测基因芯片筛查出来的5个基因(circR-0089762、circR-0077426、circR-0081545、circR-0004121 和 circR-0044837)在四组 40 个血浆样本中采用qPCR进行验证。其中3个circRNA表现与芯片结果相同,具有统计学意义。其中circR-0089762明显下调和circR-0004121显著上调,选择这两个circRNA进行进一步验证。第三部分血浆circRNAs在RA并发CHD组与对照组间表达差异的进一步验证及临床应用研究进一步验证第二部分中选择出的circR-0089762和circR-0004121,circR-0089762 RA合并CHD组与单纯RA组表达量具有明显的统计学意义(P<0.021)。circR-0004121 RA合并CHD组与其他三组表达量比较,具有显著的统计学意义(P<0.01)。两个circRNA诊断RA合并CHD ROC曲线下面积分别0.269(95%CI:0.170-0.284)和0.807(95%CI:0.689-0.926);与常规血清学指标进行相关性分析:circR-0089762与CRF、RF、hs-TnT和Hcy密切相关;circR-0004121与PCT、Hs-TnT和Hcy密切相关。单一指标诊断RA合并冠CHD诊断指数不十分理想。联合指标能提高诊断效能和诊断指数,hs-TnT联合circR-0089762或circR-0004121;Hcy联合circR-0089762;circR-0089762联合circR-0004121 作为生物标志物对于诊断、预测和预防RA患者可能出现CHD的并发,具有较为重要的参考价值。结论1.RA合并CHD患者相比较单纯RA患者、单纯CHD患者和健康人群血浆circRNA表达谱发生了明显变化,显示这些表达差异的circRNA可能与RA合并CHD的发生密切相关。2.通过验证circR-0089762和circR-0004121在RA合并CHD患者中表现为明显的下调和上调,这提示可能与RA合并CHD的发生发展有一定关系。3.circR-0089762 与临床指标 CRP、RF、hs-TnT 和 Hcy 有相关性,circR-0004121与PCT、hs-TnT、和Hcy存在相关性。4.circRNA联合常规血清学指标可提高诊断效能,hs-TnT联合circR-0089762或 circR-0004121;Hcy 联合 circR-0089762;circR-0089762 联合 circR-0004121对于RA合并CHD的诊断具有重要参考价值。