根瘤的产生是一个复杂的生物学过程,包括根瘤菌侵染植物根部细胞,植物根部细胞分化,根瘤的成熟和固氮。在结瘤过程中,宿主植物根部细胞大量基因差异表达,构成复杂的基因表达调控网络。结瘤素基因是在结瘤过程中特异表达或表达增强的豆科植物基因。目前,豆科模式植物蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）和日本百脉根（Lotus japonicus）中的许多结瘤素基因已经被分离鉴定,但是对于豆科树种,如刺槐,关于其结瘤机理的研究尚未开展,刺槐结瘤素基因尚未被报道。因此,从转录组水平上全面系统了解刺槐在结瘤过程中的基因差异表达谱,分离鉴定结瘤素基因,是研究刺槐结瘤机制的有效手段,对分离鉴定出的结瘤素基因,利用反向遗传学方法—RNA干扰诱导的基因沉默来分析结瘤素基因的功能,为阐明刺槐结瘤分子机理奠定基础。本文以刺槐（Robinia pseudoacacia）与中慢生根瘤菌（Mesorhizobium amorphae CCNWGS0123）建立的共生结瘤体系为研究对象,使用抑制差减杂交技术对刺槐结瘤过程中其根部基因的差异表达进行分析,构建正、反交2个差减c DNA文库,克隆差异表达基因;利用q RT-PCR验证结瘤相关基因在根瘤发育不同阶段的表达趋势;使用RACE方法,克隆目的基因全长,运用生物信息学分析候选基因的基本特征;使用RNAi技术对候选基因进行初步的功能分析。主要研究内容及结果如下:1.为更清楚观察M.amorphae CCNWGS0123的侵染过程,使用绿色荧光蛋白标记该菌株,把Plac Z–egfp质粒p MP2444通过电穿孔转入M.amorphae CCNWGS0123中,标记后的菌命名为G186,在紫外光下能发出绿色荧光。使用荧光显微镜观察记录G186入侵刺槐根部的过程,根据观察结果,验证了刺槐根瘤菌通过侵入线进入刺槐根皮层细胞,与其他豆科牧草植物相比其整个结瘤周期较长。我们把刺槐结瘤过程分为三个阶段:早期阶段,接菌后0-7d,出现根毛变形,大量根瘤菌被包裹到变形的根毛中;中期阶段,接菌后7-18d,侵入线及根瘤原基已经形成,位于侵入线中的根瘤菌开始释放到根瘤原基中;晚期阶段,接菌后18d及以后,根瘤成熟,开始行使固氮功能。2.分别对苗龄1、4、6、8、11、14、18和22 d的刺槐接菌根和不接菌的对照根取样,抽提样品总RNA并从中分离纯化出m RNA,利用抑制差减杂交技术分离两个样品间差异表达基因,构建了正、反交两个差减c DNA文库,每个文库包含大约600个克隆子。其中正交文库（Forward SSH library,FSL）筛选得到的是相对于不接菌根,在接菌根中特异性表达或者表达量增加的基因;反交文库（Reverse SSH library,RSL）筛选得到的是相对于接菌根,在不接菌根中特异性表达或表达量增加的基因。为去除抑制差减杂交过程中产生的假阳性片段,利用反向斑点杂交（RDB）对差减文库中的克隆子进行第一次筛选,以371个正交克隆子和247个反交克隆子点膜,杂交后选取正向探针杂交信号高于反向探针5倍的样点,送样测序。这些实验结果为研究刺槐结瘤素基因奠定分子基础。3.根据反向斑点杂交筛选结果,从两个文库中共选取251个正、反交克隆子进行测序。去除测序结果差的,共得到212个序列,使用TIGR assembler装配成135 singletons和27 contigs,最终得到162 unigenes（正交序列114条/反交序列48条）,序列片段在200 bp到900 bp之间。这些序列被提交到NCBI db EST数据库中,分配的Genbank accession numbers是JK974084-JK974245。162 unigenes在NCBI非冗余蛋白数据库中进行BLASTX序列比对,根据注释结果把162个ESTs人工归类为14个功能类群。在14个功能类群中,其中占比例最大的是未知功能类群（23%）,大量未知基因的筛选证明了目前刺槐基因组信息的缺乏。由于本实验的重点是寻找结瘤过程中表达增强的基因,所以我们把正交文库中的基因作为研究的重点,根据BLASTX功能注释和GO（Gene Ontology）功能分类,正交文库的114 unigenes重新分为13个类群。根据BLASTX结果,80 unigenes（70%）编码的蛋白能在NCBI蛋白数据库中找到相似序列。在这些注释的基因中,占比例较大类群的是参与转录调控（10.5%）、蛋白质的代谢与合成（14.0%）、防御（10.5%）及信号传递（7.9%）相关的基因。因此我们推测,在刺槐共生结瘤固氮过程中,发生了不同水平的分子调控,包括转录调控、转录后调控、翻译调控及翻译后调控。调控类基因通常在结瘤过程中行使重要作用,因此我们从正交文库中挑选可能与转录调控、蛋白质的合成与代谢、信号传导相关的调控类基因28条,通过RT-PCR分析,其中21个基因在接菌根中表达上调,包括9个转录调控类基因、8个翻译后修饰基因及4个膜蛋白基因。使用q RT-PCR对这些上调基因进行进一步表达谱分析。最后使用RACE方法获取目的基因的全长,并对部分基因用Clustal W进行多重序列比对找到蛋白质保守区域。4.通过q RT-PCR的方法从抑制差减杂交正交文库中筛选到5个晚期结瘤素基因,分别是:2zheng43、2zheng44、2zheng45、2zheng190和2zheng287,五个基因在刺槐结瘤过程中的时空表达特征分析表明,这些基因在晚期结瘤根（18 dai,24dai）和根瘤（N30）中特异诱导表达,而在早期结瘤根（0、7、10、14 dai）、去瘤根（Root 30）、不结瘤对照根（CK30）及结瘤植株的茎（Stem）、叶（Leaf）中不被诱导表达（2zheng43除外）,因此这些基因是典型的晚期结瘤素基因,并且除2zheng43外,其他4个基因是特异表达的晚期结瘤素基因,这些基因可能与刺槐根瘤形成或维持根瘤功能相关。利用RACE方法获得5个基因的全长:2zheng43（1455 bp）、2zheng44（608 bp）、2zheng45（656 bp）、2zheng190（580 bp）和2zheng287（689 bp）,分别编码412、152、106、86和113个氨基酸,编码的蛋白分别是:糖基水解酶超家族蛋白（2zheng43）、豆血红蛋白（2zheng44）、锌指结构超家族（2zheng190）、假定膜蛋白（2zheng45）,2zheng287在BLASTX比对中无相似序列,只在BLASTN比对中与山羊豆（Galega orientalis）的根瘤特异表达m RNA有较高相似性。Inter Pro Scan预测2zheng45编码蛋白的前43个氨基酸和2zheng43蛋白的前28个氨基酸序列是典型的信号肽结构,并且2zheng45编码蛋白含有一个跨膜结构区。5.建立了发根农杆菌K599诱导的刺槐毛状根转化体系,利用RNAi研究了2zheng43、2zheng45、2zheng190和2zheng287（2zheng44编码的豆血红蛋白功能已知）在根瘤发育过程中的功能。为验证目的片段沉默效果,使用q RT-PCR检测干扰基因在接菌后20d、30d和40d的RNAi根瘤和对照根瘤中的相对表达量。结果显示,在相应的RNAi干扰根瘤中2zheng43和2zheng45基因被有效沉默。统计接种后10d、20d、30d和40d的2zheng43和2zheng45RNAi植株的结瘤情况,发现与对照植株相比,RNAi植株结瘤数目偏少,根瘤个头小,并且白色无效瘤比例高。用q RT-PCR检测接种后20d、30d和40d的干扰植株与对照植株的根瘤中豆血红蛋白基因的转录活性,结果表明:与对照株根瘤相比,2zheng43和2zheng45RNAi根瘤中豆血红蛋白基因表达量明显下降。根据根瘤石蜡切片显示的根瘤内部特征,接种后20d和40d的对照株根瘤表现出较好的状态,根瘤中含菌细胞密实规律排布,形状规则,然而在RNAi根瘤中,含菌细胞分布松散没有规律,形状不规则,有些侵染线中的根瘤菌没有释放到根瘤细胞中。特别是40dai的2zheng43RNAi根瘤中含菌细胞数目少,并且形状不规则,有衰老迹象。由以上结果可知,2zheng43和2zheng45基因表达抑制后,其植株表现为延缓了根瘤发育、根瘤固氮能力下降,说明这些基因及其编码蛋白在根瘤发育和固氮方面发挥着重要作用。