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第一部分 Diosmetin对慢性哮喘小鼠模型气道重塑的影响[目的]支气管哮喘是一种以气道高反应性、气道炎症以及气道重塑为特征的慢性变应性的疾病。已有研究表明黄酮苷类Diosmetin能够改善胰腺炎的炎症,但是其在哮喘中的作用并不清楚。因此,本研究重点探讨Diosmetin对哮喘特别是对OVA(ovalbumin,鸡卵清蛋白)诱导的慢性哮喘小鼠模型气道重塑的影响。[方法]建立慢性哮喘小鼠模型,BALB/c小鼠于第0、7、14天通过腹腔注射OVA致敏,自第16天起每周3次,连续8周雾化OVA激发。给药组在每次激发前30 min腹腔注射Diosmetin(0.05、0.1、0.5、1mg/kg)。末次激发24 h 后,测量 AHR(airway hyperresponsiveness,气道高反应),并取 BALF(bronchoalveolar lavage,支气管肺泡灌洗液)、血清以及肺组织。ELISA(Enzyme-linked immuno sorbent assay,酶联免疫吸附法)检测各组小鼠BALF中 TGF-β1(transforming growth factor-β1,转化生长因子 β1)和血清中 OVA特异性IgE水平;肺组织病理切片行H&E(haematoxylin and eosin staining,苏木精-伊红)、PAS(periodic acid-schiff,过碘酸-雪夫)、Masson染色分别观察气道炎症浸润、杯状细胞增生以及纤维增生情况,IHC(immunohistochemistry,免疫组织化学法)检测 α-SMA(smooth muscle actin alpha chain,α-平滑肌肌动蛋白)及 MMP-9(matrix metallopeptidase-9,基质金属蛋白酶)蛋白的水平;western blot(蛋白质印迹法)检测肺组织中α-SMA、MMP-9及 VEGF(vascular endothelial growth factor,血管内皮生长因子)的表达。[结果]OVA诱导的AHR、BALF中总细胞计数、嗜酸性粒细胞数以及血清OVA特异性IgE较正常对照组均显著增加(P<0.05),而Diosmetin给药后可明显降低AHR、嗜酸性粒细胞计数以及血清OVA特异性IgE的水平(P<0.05);造模组小鼠气道出现明显的炎症细胞浸润、杯状细胞增生、胶原沉积和纤维化,而Diosmetion处理后炎症细胞浸润、杯状细胞增生明显减少(P<0.05),胶原沉积和纤维化的程度也明显减轻;此外,Diosmetin可显著抑制OVA诱导的α-SMA的表达(P<0.05),表明Diosmetin可能具有抗平滑肌增殖的效应;同时,TGF-β1的水平、MMP-9和VEGF蛋白表达在Diosmetin治疗后显著下调(P<0.05),推测Diosmetin抑制气道重塑可能是通过下调TGF-β1的水平、抑制VEGF和MMP-9的表达。[结论]Diosmetin可抑制OVA诱导的慢性哮喘模型小鼠的AHR、气道炎症和气道重塑,抑制TGF-β1、α-SMA、MMP-9和VEGF的水平,表明了 Diosmetin为慢性哮喘气道重塑的治疗提供了新的思路。第二部分Dismetin预防TGF-β1诱导的EMT及机制研究[目的]EMT(Epithelial-mesenchymal transition,上皮间质转化)在哮喘、肺纤维化等呼吸系统疾病的气道重塑中伴演着重要角色。研究已显示黄酮类Diosmetin能够改善慢性哮喘的气道重塑,但其在EMT的影响尚不清楚。因此我们探讨Diosmetin对TGF-β1诱导的EMT的影响以及其潜在机制。[方法]体外培养HBE(human bronchial epithelial,人支气管上皮)细胞。采用CCK-8(cell counting kit-8,细胞计数)法检测不同浓度Diosmetin对HBE细胞活力的影响;细胞划痕和细胞迁移实验观察细胞迁移变化;流式细胞术及共聚焦显微镜形态学分析检测TGF-β1诱导的ROS(reactive oxygen species,活性氧)的水平;免疫荧光检测N-cadherin(N-钙粘素)、E-cadherin(E-钙粘素)、α-SMA 的表达水平;western blot 检测 N-cadherin、E-cadherin、α-SMA、氧化酶(NADPH oxidase 4,NOX4)及抗氧化酶超氧化物歧化化酶(superoxide dismutase,SOD)和 catalase 的表达,并检测相关通路 p38、Erk、JNK、Akt及其磷酸化水平。[结果]CCK-8法结果发现10、20、40 μM Diosmetin作用24 h后,HBE细胞活力分别为98%、96%和92%。与control组比较,TGF-β1能够促进HBE细胞的EMT以及ROS的产生(P<0.05),Diosmetin给药后能够显著抑制TGF-β1诱导的细胞迁移,并逆转N-cadherin、E-cadherin以及α-SMA的表达(P<0.05);同时,Diosmetin能够降低细胞内ROS的产生,并显著下调NOX4的表达,上调 SOD 及 catalase 的表达(P<0.05);此外,TGF-β1可促进 p38、Erk、Akt的磷酸化(P<0.05),而Diosmetin显著抑制TGF-β1诱导的MAPK信号通路,减少p38、Erk、Akt的磷酸化水平(P<0.05)。[结论]我们的研究首次证明Diosmetin减轻TGF-β1诱导的EMT,其可能通过抑制ROS的产生以及抑制MAPK信号通路的激活,从而发挥抗重塑作用。