【摘 要】
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人体需要的重要维生素有很多种,维生素B6就是其中之一,它是吡啶一类的化合物,游离形式分别为:吡哆醇(Pyridoxine,PN)、吡哆胺(Pyridoxamine,PM)以及吡哆醛(Pyridoxal,PL),它
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人体需要的重要维生素有很多种,维生素B6就是其中之一,它是吡啶一类的化合物,游离形式分别为:吡哆醇(Pyridoxine,PN)、吡哆胺(Pyridoxamine,PM)以及吡哆醛(Pyridoxal,PL),它们相对应的磷酸酯形式则分别为磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5’-phosphate,PNP)、磷酸吡哆胺(Pyridoxamine-5’-phosphate,PMP)还有磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate,PLP)。在VB6的六种不同形式中,PLP是它的主要辅酶形式,参加了催化涉及氨基酸的很多反应,在多种其他物质的合成、代谢过程中也发挥了重要作用。自然界中,维生素B6存在从头合成途径和代谢转换途径两种代谢途径。它们中代谢转换途径涉及到不同构型VB6之间的转化;并且有很多酶参与其中的各种转换反应,其中就包含了吡哆醛还原酶(PLR)、吡哆醇氧化酶(PNPO)、吡哆醛激酶(PLK)以及磷酸酶等。谷草转氨酶(GOT)是存在于几乎所有真核生物体内的一种胞内酶,是生物体内众多转氨酶中很重要的一个。目前已经有人研究谷草转氨酶与维生素B6代谢的关系,证明在动物和微生物中GOT在脱去辅酶PLP后,可以催化PM与PL之间的转化反应。烟草作为一种模式植物,是植物生理生化等研究的很好的材料。本实验通过NCBI在线网站搜索得到烟草中谷草转氨酶基因(命名为NtGOT),该基因全长1386bp,共编码462个氨基酸,蛋白的分子量大小为50.7KDa,等电点为8.37;多物种氨基酸比对结果显示,NtGOT与很多物种有高度的保守性。实验中构建了pMal-c2x-NtGOT原核表达载体,成功的通过大肠杆菌表达出NtGOT蛋白。通过酶活测定明确所得到的NtGOT可以催化谷氨酸和草酰乙酸(OAA)之间的转氨基反应,同时该酶也参与PM和PL之间的转换反应。辅酶PLP对酶活的影响很大,实验中我们采用硫酸铵沉淀法逐步脱去NtGOT上的辅酶PLP,发现其催化PM和PL反应的速率随着辅酶的脱去,逐渐增大;当外源添加PLP或者PMP后,催化PM和PL转换的反应受到抑制。实验中还确定了NtGOT在参与PM和PL转换反应的最佳氨基受体是α-草酰乙酸;最适条件下测得的NtGOT参与PM和PL转换反应的表观Km=2.35mM,Vmax=1.16pmol/min/ug pro.。通过实验我们明确NtGOT参与的PM和PL之间的转换反应是其催化谷氨酸和草酰乙酸转氨基反应中的半反应。
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