斑马鱼Lamin A基因编码序列的克隆与Lamin A-EGFP-pCS2+重组质粒的构建

来源 :贵阳医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xst191217
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目的:克隆斑马鱼Lamin A的基因编码序列,并构建Lamin A-EGFP-pCS2+的重组质粒,用SP6酶制备正义的mRNA。  方法:收集多个时相的野生型斑马鱼胚胎,TRIZOL法提取总RNA,RT-PCR法扩增Lamin A基因编码序列,将得到的Lamin A与EGFP-pCS2+分别用BamH I、EcoR I酶双酶切后,将Lamin A插入EGFP-pCS2+质粒中。对重组质粒进行双酶切、菌落PCR及插入片段进行测序鉴定后,用Not I酶线性化质粒,通过SP6酶体外转录合成了融合了EGFP的Lamin A mRNA。  结果:通过RT-PCR技术扩增出1977bp的Lamin A扩增产物,构建的Lamin A-EGFP-pCS2+重组质粒经双酶切、菌落PCR及插入片段的测序后与预期结果相符,用SP6酶体外转录获得的5‘端加帽的正义mRNA,通过胚胎显微注射,观察到绿色荧光蛋白的表达。  结论:克隆了斑马鱼Lamin A基因编码序列,并构建了Lamin A-EGFP-pCS2+重组质粒,并制备了5‘端加帽的正义mRNA。
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目的:探究用永分化的人角质形成细胞(HaCaT)和黑素细胞(Melanocytes,MCs)混合培养接种于去表皮的真皮(De-epidermized dermis,DED),体外构建含黑素的组织工程皮肤。  方法:1.采用两