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超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)又被称为肝蛋白,简称为SOD。SOD是超氧阴离子自由基(·2O)的专一性清除剂,能够预防和治疗超氧阴离子引起的多种疾病如风湿性关节炎、肺气肿、老年性白内障等。目前,SOD除了药用外已被添加至多种食品和化妆品中来作为保健品及延缓衰老。因此,SOD是很有前途的一种蛋白酶,有着非常广泛的应用前景。但是由于天然SOD在体内具有许多缺点如:停滞期短、不稳定、免疫原性、易于被蛋白酶水解等,从而影响到大规模生产及广泛的应用。因此,为了克服上述缺陷,设计开发出活性高、稳定性强的新型SOD就非常必要。本课题主要是通过PDB(Protein Data Bank)数据库得到小鼠的Cu,Zn-SOD三维晶体构象,使用Discovery Studio 4.0蛋白设计软件对Cu,Zn-SOD蛋白质的非保守区序列进行基于热稳定性的虚拟氨基酸突变和分子动力学模拟,根据折叠自由能的差值ΔΔGmut变化确突变氨基酸位点组合,并通过分子动力学模拟得到最后的突变氨基酸位点。然后通过实验的方法构建野生型和突变型的重组表达质粒并转入大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)中进行克隆和表达,对表达得到的Cu,Zn-SOD(Wild Type)及MCu,Zn-SOD(Mutant)的热稳定性进行验证。本课题的主要过程及结果如下:1.自NCBI获得来自猩猩、牛、羊、人等的Cu,Zn-SOD的氨基酸序列,将以上氨基酸序列与Mus Musculus的序列通过软件ClustalX2进行氨基酸序列的比对,并由DNAman分析得到小鼠Cu,Zn-SOD的保守序列,将相对应的27个非保守氨基酸序列作为待突变的位点;2.通过PDB数据库获得Mus Musculus的Cu,Zn-SOD三维空间结构(登录号:3GTT)并载入软件Discovery Studio 4.0中,采用虚拟氨基酸定点突变技术,将Cu,Zn-SOD中待突变的非保守氨基酸分别突变为其他的19种氨基酸,根据能量变化最终得到单点突变(S-MSOD)、双点突变(D-MSOD)和三点突变(T-MSOD)的突变能变化最优的TOP5突变体;3.通过对WT-SOD、S-MSOD、D-MSOD和T-MSOD的突变能变化最优的TOP5突变体进行10 ns分子动力学模拟,由Analysis Trajectory模块进行分析得到RMSD、RMSF、Potential Energy、Bond Energy等数据,从中确定最优的单点突变为:Q49W;双点突变为:Q49W/G90I;三点突变为:V30W/Q49W/G90I;4.从小鼠血液中提取RNA,并通过PCR、Overlap PCR、酶切、连接、转化等步骤构建重组质粒pGEX6p-1-SOD、pGEX6p-1-S-MSOD、pGEX6p-1-D-MSOD、pGEX6p-1-TMSOD;5.将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,反复冻融法破菌后对全菌液、上清及沉淀进行SDS-PAGE电泳,确定Cu,Zn-SOD上清中在16 kD左右处产生特异性蛋白条带,说明Cu,Zn-SOD有适量可溶性表达。以GST琼脂糖为介质利用亲和层析法纯化得到野生型融合蛋白GST-SOD及突变型融合蛋白GST-MSOD。Thrombin凝血酶对融合蛋白切割得到SOD和MSOD纯品;6.25℃,邻苯三酚自氧化法测定野生型SOD及突变型SOD比活。比活测定结果为:WT-SOD比活为714 U/mg;S-MSOD比活为839 U/mg;D-MSOD比活为632 U/mg;T-MSOD比活868 U/mg;S-MSOD比WT-SOD酶活提高17.5%;T-MSOD比WT-SOD酶活提高21.6%;D-MSOD较WT-SOD酶活降低13%;7.WT-SOD和MSOD稳定性测定:当在85℃温度条件下处理1 h,WT-SOD的相对酶活剩余为10%左右;T-MSOD蛋白的稳定性较WT-SOD有明显提高,其相对酶活剩余为35%左右;而D-MSOD则较WT-SOD稳定性有一定的降低,其相对酶活剩余为7%左右;S-MSOD较WT-SOD稳定性也有明显的提高,其相对酶活剩余为20%左右。