别藻蓝蛋白是藻胆蛋白中的一种，主要存在于蓝藻和红藻中，是一种辅助色素蛋白，在生物体中主要担任能量传递与部分能量贮存的功能，具有荧光特性。别藻蓝蛋白具有广阔的应用前景，它除了可用于食品、化妆品等领域外，还可将其制成荧光试剂，在生物医学等领域得以应用。目前别藻蓝蛋白获取的主要途径为从藻体中提取。别藻蓝蛋白的获取需经过藻种培育、提取纯化等过程，获取周期长、分离纯化困难、制备成本高，这很大程度上限制了它的应用，成为别藻蓝蛋白荧光探针试剂化、商业化的主要限制因素。为了更加快速、简捷地获取别藻蓝蛋白，分子生物学方法过程简单、提取纯化方便、制备成本低，成为现阶段热门的制备研究方法。但通过生物学基因克隆手段获得的重组别藻蓝蛋白荧光稳定性差，在受热、pH值变化以及长时间放置的情况下容易变性，直接限制了它在荧光试剂方面的应用。本试验首先对重组别藻蓝蛋白发酵条件进行优化，利用响应面法优化别藻蓝蛋白在大肠杆菌体内的重组表达条件，最后获得的最佳发酵条件为：诱导温度28℃、发酵培养基初始pH8.5、诱导时间3h、IPTG终浓度0.1mM，利用该条件发酵得到的重组别藻蓝蛋白含量与优化前本试验原始诱导条件诱导的结果(即表达量9mg/L)相比较，蛋白表达量增加为原来的2.3倍(即表达量20.4mg/L),与文献报道的重组别藻蓝蛋白α亚基蛋白表达量3-12mg/L[54]相比较，表达量提高了70%-580%。在发酵结果高效稳定的前提下，对重组别藻蓝蛋白的稳定性从分子水平和结构水平两方面入手展开试验研究分析。在其分子水平分析中，通过比对两种不同藻种集胞藻(Synechocystis sp. PCC6803)和嗜热藻(Thermosynechococcuselongatus BP-1)别藻蓝蛋白β亚基的氨基酸序列，发现了14个位点的氨基酸不同（我们将其定义为差异位点），通过定点突变、发酵表达及热稳定性分析等一系列试验，最后获得了11个位点的14个定点突变体（其中包括11个但位点突变体和3个双位点突变体），并证明这11个位点与别藻蓝蛋白热稳定性存在很大关联，猜测其参与了别藻蓝蛋白的结构稳定性调控。在其结构水平分析中，通过追踪重组别藻蓝蛋白合成的整个生物反应过程，对过程中与重组别藻蓝蛋白稳定性相关的因素进行试验分析。试验比较了不同裂合酶的催化效果，发现不同裂合酶对色基与脱辅基蛋白的催化结合作用存在明显差异；同时通过基因工程手段表达获得色基、裂合酶和脱辅基蛋白的单一物质，实现了重组别藻蓝蛋白色基与脱辅基蛋白的体外催化合成及重组别藻蓝蛋白三聚体的体外自组装，摸索了重组别藻蓝蛋白的体外催化合成及自组装试验条件，通过体外催化合成试验获得的重组别藻蓝蛋白(APC-α, APC-β)色基结合率分别由原来的28.6%和14.3%提高至90%左右，分别为原色基结合率的3倍和6倍，色基结合率提高效果显著；试验分别通过藻体提取、直接表达获取以及表达后进一步体外催化组装方法获得三种色基结合率不同的别藻蓝蛋白三聚体（即色基结合率：天然APC＞组装APC＞表达APC），对三种别藻蓝蛋白三聚体进行温度及pH稳定性比较分析，发现三者的温度及pH稳定性大小趋势均为：天然APC＞组装APC＞表达APC，试验证明了色基结合率的高低很大程度影响蛋白稳定性的强弱，色基结合率越高，蛋白结构越完整，从而蛋白稳定性越好。本试验研究为别藻蓝蛋白的大规模制取提供了参考，为别藻蓝蛋白的内部结构作用机理及稳定性调控深入研究奠定了基础。