病毒性传染病一直是危害我国动物养殖业的主要疾病,迄今尚无有效的治疗方法,目前主要应用疫苗进行预防。但是由于病毒的变异和某些超强毒株的出现,使免疫效果不确实,只有配合免疫增强剂才能发挥良好的防疫效果。但是,现存免疫增强剂存在许多不尽人意之处,因此,研制高效、低毒的新型免疫增强剂已成为亟待解决的问题。研究表明,许多中药具有较好的免疫增强作用,中药免疫增强剂具有显著优势。本研究在前期研究的基础上,选择淫羊藿多糖、淫羊藿黄酮、淫羊藿提取物、蜂胶黄酮、蜂胶提取物等组成复方,比较它们的免疫增强作用,筛选出一个作用较好的复方,命名为藿蜂酮增免剂(EPI),并对其剂量、剂型、制备工艺、质量控制、安全性、临床药效和作用机理进行了系列研究。试验主要包括以下九个部分：试验Ⅰ、处方筛选试验以淫羊藿多糖加蜂胶黄酮(EPS-PF)、淫羊藿黄酮加蜂胶黄酮(EF-PF)、淫羊藿多糖加蜂胶提取物(EPS-PE)、淫羊藿黄酮加蜂胶提取物(EF-PE)、淫羊藿提取物加蜂胶黄酮(EE-PF)组成5个复方；体外试验,用MTT法测定了前4个复方对鸡外周血淋巴细胞增殖的影响。结果显示,EPS-PF的效果最好。体内试验,取14日龄非免疫健康罗曼蛋公鸡420羽随机均分为6组,除空白对照组外均用新城疫Ⅳ系苗滴鼻、点眼免疫,28日龄二免。在首次免疫同时,4个药物组分别注射前4个复方0.5 ml,疫苗对照组和空白对照组注射等量生理盐水。分别于首免前和首免后第7、14、21和28天采血,测定外周血T淋巴细胞增殖和血清抗体效价和免疫器官指数。结果显示,EPS-PF组在免疫后第14～28天的抗体效价和淋巴细胞增殖显著高于其余各组,胸腺、脾脏和法氏囊指数多显著高于其余各组。处方优化试验,比较了EPS-PF和EE-PF对新城疫苗免疫雏鸡血清抗体效价的影响。结果显示,两个复方的效果接近。因此确定中药黄酮复方免疫增强剂的处方为EE-PF,命名为藿蜂酮增免剂(EPI)。试验Ⅱ、EPI剂量筛选试验比较了EPI不同剂量的免疫增强作用。初筛试验,将EPI配成7种浓度,取14日龄非免疫健康罗曼蛋公鸡270羽随机均分为9组,除空白对照组外均用新城疫Ⅳ系苗滴鼻、点眼免疫,28日龄二免。在首次免疫的同时,7个剂量组分别每羽肌肉注射1.5、1.25、1.0、0.75、0.5、0.25、0.125 mg的EPI (0.5 mL),疫苗对照组和空白对照组注射等量生理盐水,分别于免疫后第7、14、21和28天翼静脉采血,用β-微量法检测血清NDV-HI抗体效价,同时观察给药反应。结果显示,各剂量组在各时间点的抗体效价多明显或显著高于疫苗对照组和空白对照组,0.75 mg组的效果最好,各组给药后均无异常。验证试验,以0.75 mg为中剂量,按等差数列设置高剂量(1.25 mg)和低剂量(0.25 mg),重复免疫试验,分别于首免后第7、14、21和28天检测外周血T淋巴细胞增殖和血清抗体效价的变化。结果显示,3个剂量在各时间点的淋巴细胞增殖和抗体效价均明显或显著高于疫苗对照组和空白对照组,以中剂量的效果最好,可作为雏鸡的临床应用剂量。试验Ⅲ、EPI剂型筛选试验将EP1分别制成脂质体、混悬液和水溶液3种剂型,比较它们的增强免疫作用。体外试验,取安全浓度范围内5个浓度3种剂型的EPI,分别单独或与PHA一起加入到鸡外周血淋巴细胞的培养体系中,单独或与LPS一起加入到鸡脾脏淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果显示,3种剂型的EPI在大多数浓度范围内均能单独或协同PHA或LPS显著促进T、B淋巴细胞的增殖。体内试验,将14日龄雏鸡随机均分为5组,每组50只,分别用新城疫Ⅳ系苗免疫。同时每组分别肌肉注射3种剂型的EP1 0.5 mL/只。分别于首免后第7、14、21和28天,检测外周血T淋巴细胞增殖、血清抗体效价和血清IFN-γ、IL-6含量的变化。结果显示,3种剂型的EPI均能促进淋巴细胞增殖,提高抗体效价,促进IFN-γ和IL-6分泌。综合比较,脂质体的效果最好,混悬液次之。考虑脂质体的生产成本和稳定性,选择混悬液为EPI的剂型。试验Ⅳ、EPI制备工艺的研究研究了EE和PF的提取以及助悬剂的用量。EE提取试验,以EE得率和EPS含量为指标,对3次煎煮时间、加水倍数进行正交试验。结果表明,加水倍数对2个指标的影响最大,确定EE提取的最佳工艺为加20倍量水煎煮2次,第一次1.5 h,第二次1h。PF提取试验,以蜂胶黄酮的得率、含量和净重量为指标,比较了乙醇溶解法、乙醇溶解加乙酸乙酯萃取法的差异,结果表明,两种方法所得蜂胶黄酮无明显差异,但乙醇溶解法更经济、简便,因此选定乙醇溶解法为PF的制备工艺。助悬剂用量试验,在预试验筛选出甘油、聚乙二醇-400为助悬剂的基础上,比较了7种浓度的乙醇(蜂胶黄酮溶媒)和2种助悬剂对蜂胶黄酮的溶解性、制剂的性状和稳定性的影响,确定了制剂中乙醇、甘油、聚乙二醇的含量分别为6.0%、3.5%、6.5%。试验V、EPI质量控制的研究研究了EPI的鉴别和含量测定。淫羊藿苷的鉴别,比较了3种取样量、2种点样量的薄层色谱效果,结果显示,斑点的清晰度和深度随着取样量和点样量的增加而增加,分别确定10 m1、4μl为合适的取样量和点样量。高良姜素和白杨素的鉴别,比较了4种展开剂、5种点样量的薄层色谱效果,结果显示,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10：4：3)为展开剂的分离效果最好；随着点样量的增加,色谱斑点逐渐加深,但拖尾现象也逐渐加重,选择3山为合适的点样量。含量测定试验,建立了淫羊藿苷、高良姜素和白杨素含量测定的高效液相色谱法,并对方法进行验证。结果表明,对照品溶液中淫羊藿苷在2.5-80μg/m1、高良姜素和白杨素在15.625～250μ/ml呈良好的线性关系,精密度和回收率较高,供试品溶液在9 h内稳定。试验Ⅵ、EPI安全性测定按照兽药试验技术文献规定的方法测定了EPI的急性毒性、长期毒性和特殊毒性。急性毒性试验结果显示,在每次给药后半小时内,小鼠有精神稍差、食欲减退、扎堆等不适反应,但很快恢复正常,此后再未出现任何异常反应,14天内所有小鼠无1例死亡,最大给药量为6000 mg/kg。长期毒性试验结果显示,在给药期间,高剂量组小鼠体重有所减轻,但与对照组无显著差异,高剂量组白细胞总数显著大于对照组,各组血清丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶和尿素氮无显著差异,高、中剂量组的脾指数显著大于对照组,剖检和组织学检查未见明显异常；在停药后14天,各项异常指标全部恢复正常。特殊毒性试验结果显示,EPI无致敏性,体外无溶血性,对家兔股四头肌、眼结膜无刺激性。以上结果表明,EPI无毒,无明显的长期性毒性特殊毒性,临床应用安全。试验Ⅶ、EPI佐剂活性的测定测定了EPI对禽流感疫苗和新城疫疫苗的增强免疫作用。禽流感免疫试验,以禽流感疫苗用灭活抗原、EPI、油佐剂材料和注射用水分别制成每羽份含等量抗原的含高、中、低浓度EPI的佐剂疫苗、油佐剂疫苗和无佐剂疫苗,取14日龄非免疫雏鸡300只随机均分为6组,EPI的高、中、低剂量组分别皮下注射含高、中、低浓度EPI佐剂的禽流感疫苗,油佐剂对照组和无佐剂对照组分别注射油佐剂疫苗、无佐剂疫苗,空白对照组注射生理盐水。28日龄二免。分别于首次免疫后第7、14、21、28天,采血测定淋巴细胞增殖和血清抗体效价的变化。新城疫免疫试验,以新城疫疫苗用灭活抗原、EPI、油佐剂材料和注射用水分别制成每羽份含等量抗原的舍高、中、低浓度EPI的佐剂疫苗、油佐剂疫苗和无佐剂疫苗,取14日龄非免疫雏鸡300只,分组处理和测定同上。结果显示,EPI的高、中剂量均能够显著促进淋巴细胞增殖,提高血清抗体效价,效果优于无佐剂组和油佐剂组。表明EPI能够增强禽流感疫苗和新城疫疫苗的免疫效果,可以用作疫苗的佐剂。试验Ⅷ、EPI拮抗免疫抑制的作用测定测定了EPI对环磷酰胺诱导的免疫抑制模型雏鸡免疫功能的影响。11日龄非免疫健康罗曼蛋公鸡300羽随机均分为6组,除空白对照组外均肌肉注射8 mg/m1的环磷酰胺溶液0.5 m1,每天1次,连续3天。14日龄时,高、中、低剂量的药物试验组分别肌肉注射EP1 0.7、0.5、0.3 m1,药物对照组注射黄芪多糖注射液0.3 ml,模型对照组和空白对照组注射等量生理盐水,每天1次,连续3天。分别于给药后第7、14、21和28天每组随机抽取6羽心脏采血,用MTT法外周血T淋巴细胞增殖,并称重,扑杀后分离胸腺、脾脏和法氏囊称重,计算免疫器官指数。结果显示,在免疫后各时间点,EPI高、中剂量组的A570值、平均体重和免疫器官指数均显著高于模型组,且在大多时间点高于黄芪多糖组。表明EPI能够拮抗免疫抑制作用,可以用于免疫抑制性疾病的防治。试验Ⅸ、EPI的作用机理研究比较了两种剂型的EPI对鸡外周血淋巴细胞IL-2和IL-6的mRNA表达及鸡脾脏淋巴细胞分泌Ig G和Ig M的影响。细胞因子基因表达试验,将3种浓度、两种剂型的EPI加入到鸡外周血淋巴细胞的培养体系中,同时设PHA对照和细胞对照,培养12 h后,收集细胞,提取总RNA,反转录,用荧光定量PCR方法测定IL-2和IL-6的mRNA表达的变化。结果表明,两种剂型的EPI均能显著促T淋巴细胞IL-2和IL-6的mRNA表达,混悬型的效果优于水溶液型。Ig分泌试验,将EPI混悬液和水溶液的3种浓度(15.625、7.813、3.907μg·mL=1)单独或与LPS加入到鸡脾脏淋巴细胞的培养体系中,同时设LPS对照和细胞对照,培养24 h后,收集上清液,用ELISA法测定Ig G、Ig M的含量。结果表明,两种剂型的EPI均能显著促进B淋巴细胞分泌IgG、IgM,混悬型的效果优于水溶液。