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鼠李糖脂（Rha）是糖脂型生物表面活性剂,具表面活性高、毒性小、可生物降解等优点,可广泛应用于污染环境修复,亦能作为医疗保健品、化妆品、医药及食品、洗涤剂等的添加剂。目前多用铜绿假单胞菌发酵产鼠李糖脂,但因合成机制复杂,鼠李糖脂粗品的分离和提取成本过高,限制了其工业化应用。本文以铜绿假单胞菌NY3为受试菌株,借助分子生物学手段及仪器分析鉴定技术,以提高Rha产量和降低提取纯化费用为主要目的,展开相关研究工作,对于工业化生产具有重要意义。本文从生物合成路径着手,研究了NY3产鼠李糖脂过程中的基因调控机制,利用DNA重组技术构建了一株高产鼠李糖脂的NY3突变株,并优化了该菌发酵产鼠李糖脂及其产品分离、纯化的工艺条件,获得以下成果。（1）成功扩增出铜绿假单胞菌NY3野生菌细胞内的phaG基因,通过DNA重组技术构建出了具有抗链霉素基因及能阻止phaG表达的自杀性重组质粒PEX18-phaG-SmR。并通过三亲株杂交方法将该重组质粒整合至野生NY3菌基因组上,成功构建出了phaG基因缺失突变株NY3?phaG。（2）突变株NY3?PhaG能以菜籽油为碳源发酵产鼠李糖脂,其产物与NY3野生菌相比,产量和纯度分别提升了56%和6.7%,同时改善了乳化性能。（3）获得响应面法优化突变株NY3?phaG发酵产Rha的最佳培养基配方为碳源（菜籽油）60g/L,氮源（NaNO3）5.69g/L,微量元素1.48mL/L,Na2HPO40.75g/L,KH2PO4 0.75g/L,MgSO4·7H2O 0.06g/L,CaCl2·2H2O 0.01g/L,初始pH 7.5。该优化条件下,突变株发酵鼠李糖脂的产量提高了54.5%。（4）从粒径不同的硅胶产品中,筛选出分离纯化鼠李糖脂最佳的柱层析填料为薄层层析硅胶。用该填料的层析柱既能较好的分离单/双糖鼠李糖脂,又能脱除鼠李糖脂中的色素类杂质,每种洗脱剂为100mL,柱流速为2mL/min,且依次按氯仿、“氯仿:乙酸乙酯=2:1”、乙酸乙酯、“乙酸乙酯:甲醇=1:2”、甲醇等顺序进行洗脱,可获得Rha纯度为87.68%的双鼠李糖脂。