论文部分内容阅读
仔猪早期腹泻和断奶应激是严重影响养猪生产效益的主要因素,过去几十年通常用抗生素促生长添加剂(Antibiotic Growth Promoters,AGPs)来控制。随着饲用抗生素添加剂的禁止使用,如何在饲料无抗的条件下有效预防仔猪腹泻,缓解仔猪断奶应激,成为保障养猪生产高效健康发展亟待解决的重要问题。完善而成熟的免疫系统是宿主抵抗疾病的重要保证。然而,新生仔猪的免疫系统尚未成熟,对病原感染的抵抗力差。仔猪出生后肠道免疫系统的快速发育与肠道菌群的演替密切相关。在肠道菌群发育的关键“窗口期”实施早期干预,可能是加速菌群演替,从而促进仔猪免疫发育的重要途径。本实验室前期研究发现,将妊娠母猪粪便菌群移植至新生仔猪体内能够调节仔猪肠道菌群,增强仔猪肠道屏障功能,从而控制腹泻促进仔猪生长性能,但尚未阐明具体机制。基于肠道菌群的定植具有“先到先留”、“供体-受体相容性”以及“氧气调控”等特点,我们假设在仔猪出生后早期,运用粪菌移植联合特定的益生菌干预,可能加速肠道菌群的演替和免疫成熟,有利于控制仔猪腹泻,提高仔猪生长速度。因此,本研究首先运用Meta分析方法,分析了限制益生菌在仔猪生产中效果的影响因素;然后研究了粪菌移植联合益生菌早期干预对仔猪生长性能和肠道的影响。在此基础上,探究了早期干预方式影响肠道菌群组成和演替的规律,初步揭示了早期干预促进免疫系统发育、降低仔猪腹泻、缓解断奶应激损伤的作用机理。主要的研究内容和结果如下:第一部分运用Meta分析研究益生菌对仔猪腹泻的效果收集了从1960年1月至2020年2月期间发表的关于益生菌影响仔猪腹泻的英文文献。经过筛选,28篇文献(包括49个试验组)被纳入本研究中。运用Meta分析方法,分别从益生菌、仔猪及文献本身三个角度分析了益生菌对仔猪腹泻效果的影响。结果表明,乳酸菌与其他菌株的组合益生菌对仔猪腹泻效果的预防作用最佳,显著降低仔猪腹泻率5.73%(95%CI 3.26–8.19;P<0.05)。酵母菌类和丁酸梭菌也能有效降低仔猪腹泻。多株益生菌组合使用的显著降低仔猪腹泻率4.25%(95%CI1.97–6.53;P<0.05),而单株益生菌能降低仔猪腹泻率4.14%(95%CI 3.64–4.64;P<0.05)。从仔猪生长阶段看,益生菌对断奶仔猪腹泻(4.58%(95%CI 4.05–5.1;P<0.05))的预防作用优于哺乳期(3.21%(95%CI 1.38–5.04;P<0.05))。从文献本身看,利用Cochrane系统对文献进行评估,文献评分不超过4分的文献中所报道的益生菌预防仔猪腹泻的效果(4.42%(95%CI 3.95–4.88;P<0.05))优于文献质量为5分的文献(1.89%(95%CI 074–3.05;P<0.05))。总的来说,益生菌能有效预防仔猪腹泻的发生,多种益生菌组合使用的效果优于单独菌株,此外,益生菌在仔猪不同生长阶段效果具有差异。第二部分粪菌移植联合益生菌早期干预对仔猪生长性能和肠道的影响选择6头妊娠70天且至少3个月以上未使用抗生素处理的长×大母猪作为本试验的粪菌供体制备粪菌悬液,粪菌浓度约为1.0×109 CFU/m L。共121窝初生重为1.55±0.35 kg的杜×长×大仔猪,随机分为6组。抗生素组(AB)的仔猪在仔猪出生后的2-3日龄进行一次性皮下注射0.3 m L头孢溶液;母猪粪菌移植组(FMT)、FMT+丁酸梭菌组(FMT+1.0×109 CFU/m L C.butyricum,FMT-C)、FMT+布拉迪酵母菌组(FMT+1.0×109 CFU/m L S.boulardii,FMT-S)以及FMT+布拉迪酵母菌+丁酸梭菌组(FMT+1.0×109 CFU/m L C.butyricum+1.0×109 CFU/m L S.boulardii,FMT-CS)。仔猪在仔猪出生后1-3日龄每天进行一次性经口灌服2ml菌液;空白对照组(CON)仔猪不进行抗生素和粪菌处理。所有仔猪在27日龄断奶,并选择500头健康且体重不低于5.5 kg的断奶仔猪进行为期5周的跟踪饲养试验。试验仔猪每周逐头称重,每天观察纪录仔猪腹泻情况并对粪便进行评分,每天记录断奶后仔猪采食量,分别在3、7、14、21、35和56日龄采集血样和粪便样本用于生化指标测定。主要结果如下:1、与CON组相比,FMT处理显著提高了仔猪断奶体重(P<0.05),有提高哺乳期仔猪ADG的趋势(P=0.0540),显著降低了仔猪哺乳期腹泻率(P<0.05),但对保育期仔猪生长性能无显著影响(P>0.05);FMT-CS显著提高了仔猪断奶重(P<0.05)及仔猪在哺乳期和保育期的ADG(P<0.05),显著降低了两个阶段仔猪的腹泻率(P<0.05)。与FMT相比时,FMT-CS显著提高保育期仔猪ADG(P<0.05)和显著降低保育期腹泻率(P<0.05)。2、运用ELISA方法检测了粪便中s Ig A和MUC2及血浆中DAO和D-LA水平。与CON组相比,FMT-CS显著降低了14、21、35和56日龄时仔猪粪便中MUC2水平,并同时显著降低了相应日龄血浆中DAO(P<0.05)和D-LA(P<0.05)浓度。与FMT组相比,FMT-CS显著降低了14和21日龄时仔猪血浆中DAO和D-LA水平(P<0.05)。说明FMT-CS显著增强了仔猪肠道屏障功能。3、运用气相色谱检测了粪便中短链脂肪酸水平,ELISA方法检测了粪便中琥珀酸含量。与CON组相比,FMT-CS显著增加了14日龄仔猪粪便中乙酸、丙酸、戊酸和总SCFA的浓度(P<0.05),并显著提高了14、21、35和56日龄仔猪粪便中琥珀酸含量(P<0.05)。与FMT相比,FMT-CS具有提高14日龄仔猪粪便中乙酸、丙酸、戊酸和总SCFA的浓度的趋势(P<0.1)。说明FMT-CS能提高仔猪肠道中有益代谢产物的产量。4、运用q PCR方法测定了仔猪粪便中选定菌群相对丰度。与CON组仔猪相比,FMT-CS处理显著降低了哺乳期的粪便大肠杆菌丰度,显著增加了3、14和21日龄仔猪乳杆菌属的相对丰度(P<0.05),并且显著增加了7、14、21日龄仔猪双歧杆菌属的相对丰度(P<0.05)。说明FMT-CS早期干预能提高厌氧有益菌相对丰度,降低兼性厌氧的有害菌相对丰度。第三部分菌群发育窗口期早期干预对新生仔猪肠道菌群、免疫发育及断奶应激的影响研究在7、27、35和56日龄,随机采集了CON组和FMT-CS组12头仔猪的粪便样品和血液样品。运用16S r RNA测序技术分析了粪便菌群,运用ELISA方法检测了血浆中白介素(interleukin,IL)-17、IL-22、IL-23、干扰素-γ、Ig G、Ig M、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、总抗氧化能力、丙二醛、总超氧化物歧化酶、DAO和D-LA的水平。与对照组相比,FMT-CS处理得到了以下主要结果:1、16S r RNA测序结果显示,FMT-CS显著增加了仔猪粪便菌群alpha多样性,显著降低了7日龄与56日龄粪便菌群Unifrac距离。此外,FMT-CS显著增加了能量代谢、糖的生物合成和代谢等基因相对丰度。2、Bugbase分析结果显示,FMT-CS早期干预降低了7日龄仔猪粪菌中好氧菌基因相对丰度(P<0.05),显著增加了27日龄粪便中应激耐受基因相对丰度(P<0.05),显著降低了35日龄致病菌基因相对丰度(P<0.05),显著增加了细菌移动元件含量基因相对丰度(P<0.05)。Lefse和Metastats分析发现,FMT-CS早期干预显著增加了7日龄仔猪粪便菌群中常见共生菌和有益菌丰度,显著降低了仔猪肠道中有害菌的丰度。FMT-CS显著增加了27日龄仔猪粪便中产SCFAs细菌,显著降低了致病菌丰度。FMT-CS显著降低了35日龄粪便中拟杆菌门的丰度,显著增加了有益菌丰度。显著降低了肠杆菌属、柯林斯氏菌及考拉杆菌属丰度。这些结果表明,FMT-CS早期干预增加了肠道中有益菌丰度,降低了有害菌丰度。3、FMT-CS处理显著增加了7日龄仔猪血浆中IL-17(P<0.05)、IL-22(P<0.05)和IL-23(P<0.05)的水平,并具有增加14日龄和21日龄血浆中IL-17和IL-22水平的趋势(P<0.1),FMT-CS处理显著增加27日龄血浆中IL-17(P<0.05)、IL-22(P<0.05)和IFN-γ(P<0.05)的水平。FMT-CS处理显著增加了整个试验周期内仔猪血浆Ig G(P<0.05)、Ig M(P<0.05)和粪便s Ig A(P<0.05)水平;显著增加了抗支原体抗体及抗圆环抗体水平(P<0.05)。这些结果表明,FMT-CS早期干预显著促进仔猪出生后早期的免疫发育和功能。4、FMT-CS早期干预显著提高35日龄仔猪血浆中CAT(P<0.05)、GSH-px(P=0.0514)、T-AOC(P<0.05)和T-SOD(P<0.05)的水平,显著降低血浆MDA水平(P<0.05);FMT-CS处理显著降低血浆中DAO(P<0.05)和D-LA(P<0.05)的水平;FMT-CS显著降低血浆中TNF-α(P<0.05)、IL-6(P<0.05)和皮质醇的水平,并增加了IL-10的水平(P<0.05)。这些结果说明,FMT-CS增强了仔猪抗氧化应激能力、增强了仔猪断奶和肠道屏障功能并降低了炎症水平,达到了缓解断奶应激损伤的效果。综上所述,本研究的主要结论如下:(1)乳酸菌类以及联合其他益生菌具有降低仔猪腹泻的效果。(2)在肠道菌群发育的窗口期,粪菌移植联合应用布拉迪酵母菌和丁酸梭菌的早期干预,促进了仔猪肠道菌群定植和成熟的速度和仔猪免疫系统的发育,增强了仔猪免疫功能。具有降低腹泻,促进仔猪生长,降低仔猪断奶应激的作用。