肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，恶性程度高，易于复发、转移。虽然近几十年来该病在治疗上已有不少进展，但总体而言，肝癌远期疗效仍然较差，预后十分险恶，因此通过预防降低肝癌发生率十分重要。细胞的异常增殖是癌变发生的主要特征，且出现较早，探索能影响肝细胞恶性增殖的药物无疑对肝癌的化学预防具有重要的价值。目前中医药在肿瘤预防领域的作用越来越受到人们的重视，已有大量研究证实部分中药可在一定程度上起到预防肝癌的作用。但由于肝癌发病机理尚未明确，预防方面的研究较为零散，中医的选方原则各家不同，机理研究多局限在对某一时期个别蛋白、基因的分析，因此至今针对肝癌尚未推出一种公认有效的预防制剂。本课题通过组织化学、免疫组化、原位杂交等方法及计算机图像分析等技术，检测了化学致癌物二乙基亚硝胺（DEN）诱导大鼠肝癌形成过程中与肝细胞异常增殖相关的部分蛋白、基因表达的动态变化和相互关系及我科研制的以“健脾疏肝”立法的药食两用中药制剂肝复健冲剂对诱发肝癌各时期上述因素异常变化的影响，旨在筛选适用、有效的中药肝癌预防制剂，并为进一步的临床试验及推广应用提供一定的理论依据。1、药物初筛：三种不同功效中药制剂作用于大鼠肝癌前病变的比较。 清热解毒、活血化瘀、健脾扶正是中医防治肝癌的三大原则，为初步筛选有效的中药预防剂，本实验按Solt-Farber法建立大鼠短期肝癌前病变模型，利用组织化学等方法，在相同条件下比较了我们临床常用的以健脾疏肝、清热解毒和活血化瘀为代表的三类不同功效的中药制剂肝复健冲剂、三石猫胶囊、复方丹参注射液对大鼠肝癌前病变特征性酶表达的影响。实验结果显示三类中药制剂对DEN致大鼠肝脏毒性损害均有一定的保护作用，对肝细胞癌前(-GT阳性灶的发生（个数/cm2）及发展（面积）均有明显的抑制效果（P<0.05）。初步证实了三类中药均能抑制DEN启动、具有酶表型改变的变异肝细胞的数量和被启动后变异肝细胞的增生，即对模型中启动和促进过程均有一定的抑制作用。尽管中药组间无统计学差异，但其中肝复健冲剂由药食两用的中药组成，长期服用对机体无害，作为肝癌的预防制剂较以三石猫胶囊、复方丹参注射液为代表的另两类中药具有一定的优越性，更易于接受。<WP=7>2、肝复健冲剂对DEN诱导大鼠肝癌发生及诱癌各时期细胞周期调控因子、增殖相关蛋白和部分癌基因、癌蛋白等异常表达的影响。 （1） 肝复健冲剂影响实验大鼠肝硬化、肝癌的发生过程。 建立DEN诱导大鼠肝癌模型，造模同时应用肝复健冲剂进行干预，初步观察了该冲剂对实验大鼠肝硬化、肝癌发生过程的影响，并通过组织病理特殊染色等方法检测了药物对肝硬化形成过程胶原纤维沉积的作用。实验中观察到所选模型中大鼠肝脏经历了炎性改变（4～8周）→伴早期肝硬化（12周）→肝硬化伴早期肝癌（16周）→肝癌及进展（20周）这一与人类肝癌相似的发病轨迹。单纯诱癌组诱癌12周时20%大鼠已有肝硬化改变；16周全部出现肝硬化，以结节性肝硬变为主，其中40%伴见早期癌变；20周时大鼠肝癌的发生率为100%。中药预防组大鼠16周才出现肝硬化，20周时肝癌发生率为80%。单纯诱癌组大鼠最长生存期为20周，中药预防组为28周。统计结果显示肝复健冲剂可有效减少DEN致大鼠肝癌的发生，延长大鼠生存期。利用计算机图像分析技术对模型大鼠肝硬化过程肝脏胶原纤维的沉积进行定量分析，发现从肝细胞变性、坏死，到肝硬化的形成过程，切片胶原呈明显的增多趋势，其变化与肝脏形态学改变相一致。中药预防组大鼠在模型肝硬化期（16周）及肝癌期（20周）肝脏胶原沉积量均明显低于单纯诱癌组，P<0.05。提示肝复健冲剂可减轻大鼠肝脏炎性损害，延长大鼠生存期，减少和延缓大鼠肝癌的发生。同时可通过抑制肝脏以I、Ⅲ型为主的胶原纤维沉积达到延缓肝硬化的发生及肝硬化向肝癌转变的作用。（2）肝复健冲剂对大鼠肝癌变过程中细胞周期调控因子和增殖相关蛋白表达的影响。为从细胞增殖角度探讨实验性肝癌的发生及肝复健冲剂的抑癌机制，本实验利用免疫组织化学等方法检测了DEN诱导大鼠肝癌形成各阶段细胞周期重要的调控因子和增殖相关蛋白的动态表达变化规律，以及肝复健冲剂对细胞增殖和周期的调节作用。结果显示：①在大鼠肝癌诱发过程中细胞周期正性调节因子cyclinD1阳性产物的累积呈逐渐增高趋势，并于模型肝癌期（20周）达到最高；而CDK4的阳性表达在诱癌4～8周较活跃，之后表达量有所下降，肝癌期（20周）再次缓慢回升。细胞周期负性调节因子P27的表达在大鼠肝癌形成过程未见明显的趋势变化。②肝癌诱发过程中阳性表达PCNA的肝细胞数随着模型的进展缓慢上升，<WP=8>在诱癌12周后呈明显攀升趋势。诱癌20周时实验大鼠进行BrdU标记后大量肝细胞呈BrdU 阳性着色。③在造模同时应用肝复健冲剂进行干预，发现该冲剂可明显抑制大鼠肝癌诱发全过程及诱癌16周肝细胞CDK4及cyclinD1的过量表达，减少诱癌16～20周阳性表达PCNA的肝细胞数及20周时肝细胞BrdU的阳性标记数，P<0.05。本部分研究结果提示DEN诱导大鼠肝癌形成过程中细胞周期重要的调控因子和增殖相关蛋白的动态表达变化有?