对绵羊瘤胃主要的几株纤维降解菌如产琥珀酸拟杆菌Fibrobacter succinogenes、白色瘤胃球菌Rumincoccus albus、黄色瘤胃球菌Rumincoccus flavefaciens和瘤胃厌氧真菌的Real-Time PCR荧光定量方法进行研究,获得如下结果:1. DNA的提取采用珠磨-SDS/CTAB/PVP法。提取的瘤胃微生物总DNA在20Kb以上,OD260/OD280在1.7以上,经过纯化后OD260/OD280均在1.8-2.0,利用真细菌、古细菌和真菌16s/18SrDNA的通用引物从纯化后瘤胃微生物总DNA中成功扩增出目标条带,表明珠磨式机械破碎法能充分破碎包括细菌、真菌等在内的各种瘤胃微生物,并满足后续实验的要求。2.以16s/18SrDNA为靶序列,利用SYBR GreenⅠ荧光染料Real-time PCR法成功对Fibrobacter succinogenes、Rumincoccus albus、Rumincoccus flavefaciens和瘤胃厌氧真菌进行了定量检测,并构建了标准品,所建立的标准曲线斜率均在-3.0左右,有效检测灵敏度可达101水平拷贝/20μL体系。对具体PCR条件进行优化后,分别在种和类的水平上,建立了采用SYBR GreenⅠ荧光染料Real-Time PCR法对瘤胃主要纤维降解菌进行绝对定量的方法,且较为快速和准确。此外还对荧光定量Real-Time PCR法计数结果和传统滚管计数法进行了相关性分析,相关系数达到了95.9%,证明了此方法在瘤胃纤维降解菌的计数方面具有较高的优越性和实用性。3.本试验还利用上述方法研究了不同精粗比日粮条件下瘤胃主要纤维降解菌区系和数量的变化。试验选用9只体况良好、体重50kg左右的苏尼特绵羊随机分为三组,每组3只。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组精粗比分别为1:9、2:8和5:5。通过应用荧光定量Real-time PCR与传统计数方法对瘤胃纤维降解菌和厌氧真菌进行计数,结果为两种方法所得结果具有一致性、变化趋势相同。传统方法试验条件下纤维降解菌群出现显著增加的趋势,但是日粮纤维素含量对瘤胃真菌数量影响不显著;而利用本试验所建立的荧光定量Real-time PCR法方法检测到的结果可以看出,Fibrobacter succinogenes、Ruminococcus flavefaciens和厌氧真菌受日粮粗纤维比例的影响显著,只有Ruminococcus albus受影响不显著,但是随着粗纤维的增加仍具有明显的增加趋势。从本试验测定结果还可以看出,定量PCR方法在监测菌群变化动态方面具有优越性,适用于监测菌群在一定时间内的变化动态,尤其适于大量样品中的某一特异菌株准确定量或追踪。