1研究背景近年来,阿司匹林抵抗问题引起广泛关注,中西药联合用药治疗冠心病等复杂疾病在临床取得了较好的疗效。通过对全国18家三级甲等综合医院信息系统数据仓库分析发现,14191例患者使用注射用丹参多酚酸盐的患者中多与阿司匹林联合用药治疗冠心病。进一步对注射用丹参多酚酸盐联合常规西药治疗稳定型心绞痛(stable angina pectoris, SAP)的随机对照试验研究进行Meta分析,结果发现联合用药治疗SAP的有效率明显优于单纯西药治疗,且未发现明显不良反应。大多数复杂疾病并非是由单个致病基因引起的,而是多个基因或其产物功能紊乱导致的结果,生物分子网络分析方法能够系统、综合地挖掘药物对疾病网络的干预与影响,进行“疾病-基因-药物”多层次网络的分析,为揭示联合用药、多分子药物协同作用于人体的作用机理提供了新的思路。2研究目的运用生物分子网络的分析方法,比较注射用丹参多酚酸盐和阿司匹林分子网络在生物功能方面的异同,从分子角度预测注射用丹参多酚酸盐与阿司匹林联合用药治疗SAP的作用机理。3研究方法3.1基因获取通过Genecards数据库和STITCH数据库获得注射用丹参多酚酸盐主要成分及阿司匹林的相关基因,通过DisGeNET数据库获得SAP相关基因,并进行去重、统一名称等处理。3.2分子网络构建通过Agilent Literature Search,参数设置以人类基因为前提,限定交互词汇,选择通过全文搜索。检索文献中与注射用丹参多酚酸盐、阿司匹林、SAP的相关种子基因有相互作用关系的基因构建生物分子网络,并在Cytoscape_v3.2软件平台对网络进行可视化加工和拓扑结构分析。3.3分子网络的模块识别将注射用丹参多酚酸盐、阿司匹林和SAP的分子网络分别导入AP、MCODE和MCL,利用3种方法根据网络中的基因聚类情况进行模块识别。熵值是对模块的离散程度进行判断的一个标准,不同方法的模块识别结果可根据模块熵值的大小进行比较,熵值越小代表模块的离散程度越小,稳定性越高。划分好的模块根据评分由高至低排序,每个模块由相互关联的基因聚类组成,评分越高表示该模块的显著性越高。3.4模块的生物功能注释使用DAVID Bioinformatics Resources 6.7软件识别注射用丹参多酚酸盐、阿司匹林和SAP分子网络的主要模块中的GO生物学过程和KEGG通路。采用Fisheris Exact Test算法计算出P值(EASE Score),再对富集分析得到的P值进行Benjamini多重检验校正,最终认为校正后P值<0.05的GO生物学过程和KEGG通路为模块相关的显著生物功能和信号通路。4研究结果4.1分子网络的构建及模块划分通过Genecards数据库和STITCH数据检索获得注射用丹参多酚酸盐的相关基因79个,阿司匹林的相关基因498个,SAP的相关基因75个。通过分子之间相互作用关系,构建出注射用丹参多酚酸盐的分子网络由715个节点和2310条边构成；阿司匹林的分子网络由2120个节点和9064条边构成；SAP的分子网络由630个节点和2385条边构成。从注射用丹参多酚酸盐的分子网络中识别出61个模块,最大模块由37节点构成,最小的模块由3个节点构成；从阿司匹林的分子网络中识别出122个模块,最大模块由112个节点构成,最小模块3个节点构成；从SAP的分子网络中识别出40个模块,最大模块由57个节点构成,最小的模块由3个节点构成。4.2 GO生物功能和KEGG通路富集注射用丹参多酚酸盐分子网络前10个模块的相关GO功能有755条、相关KEGG信号通路有61条,其中以免疫调节、信号转导、细胞过程相关信号通路为主,其还包括内分泌调节、代谢作用、神经调节等相关信号通路。阿司匹林分子网络前10个模块的相关GO功能有831条、相关KEGG信号通路有53条,以代谢作用、信号转导相关信号通路为主,还包括免疫调节、细胞过程相关信号通路。SAP分子网络前10个模块的相关GO功能有1220条、相关KEGG信号通路有65,其中以免疫调节、代谢作用、细胞过程相关信号通路为主,其次为信号转导、内分泌调节和神经调节相关信号通路。4.3联合用药对SAP分子网络及重要节点的影响注射用丹参多酚酸盐和阿司匹林分子网络对SAP分子网络的覆盖率分别为45.92%和62.56%,联合用药的覆盖率为71.64%；前10个重要节点之间的重叠率均为60%,联合用药的重叠率为80%；两个药物共同覆盖SAP分子网络的209个节点,前10个重要节点包括IL6、IL8、MAPK14和MAPK8,与炎症反应相关；注射用丹参多酚酸盐单独覆盖SAP分子网络的56个节点,AKT1和IFNG属于前10个重要节点,与动脉粥样硬化和心肌缺血再灌注损伤有关；阿司匹林单独覆盖SAP分子网络的177个基因,EPHB2和TP53属于前10个重要节点,与血管平滑肌细胞增殖相关。4.4联合用药对SAP相关信号通路的影响注射用丹参多酚酸盐和阿司匹林分别参与了64.62%和56.92%的SAP相关信号通路调节,两个药物联合能够覆盖SAP相关信号通路的86.15%,以免疫调节、细胞过程、代谢作用、信号转导相关信号通路为主。注射用丹参多酚酸盐和阿司匹林共同参与的16条SAP相关信号通路中,以免疫调节、信号转导、细胞过程、代谢作用以及肿瘤相关信号通路为主,如JAK-STAT信号通路(Janus kinase/signal transducers and activators of transcription, JAK-STAT signaling pathway)、MAPK信号通路(Mitogen-activated protein kinase signaling pathway)等,与炎症反应和动脉粥样硬化的发生发展相关。注射用丹参多酚酸盐单独参与的17条SAP相关信号通路中,以信号转导、内分泌调节、免疫调节以及糖尿病相关信号通路为主,如VEGF信号通路(Vascular endothelial growth factor, VEGF signaling pathway)、GnRH信号通路(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH signaling pathway)、1型糖尿病信号通路(Type I diabetes mellitus)等,与调节内皮细胞功能和糖代谢相关。阿司匹林单独参与的11条SAP相关信号通路中,以代谢作用、细胞过程、免疫调节以及神经系统疾病相关信号通路为主,如花生四烯酸代谢(Arachidonic acid metabolism)、亚油酸代谢(Linoleic acid metabolism)、阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease)等信号通路,与血小板聚集和调节脂代谢相关。5结论(1)注射用丹参多酚酸盐联合阿司匹林通过对炎症反应相关因子及信号通路的调节,从抑制动脉粥样硬化发展方面对治疗SAP起到疗效增强作用。(2)注射用丹参多酚酸盐联合阿司匹林通过对血小板聚集、内皮细胞和糖脂代谢相关信号通路的调节,对治疗SAP起到疗效相加作用,同时能够降低高血糖引起的阿司匹林抵抗。(3)注射用丹参多酚酸盐可能通过对血管内皮细胞功能的调节降低阿司匹林的血风险。