论文部分内容阅读
目的通过建立颈动脉球囊损伤内膜增生模型,验证球囊损伤后血管平滑肌细胞增殖的特点,观察DNA损伤的严重形式DNA双链断裂及其修复是否参与内膜增生过程,从新的角度揭示内膜增生的潜在机制。再者通过H2O2诱导血管平滑肌细胞产生氧化DNA损伤,观察细胞内DNA修复特点及相关的聚（ADP-核糖）化（PARylation）修饰及相关蛋白表达情况,解释其与氧化DNA损伤相关的血管平滑肌细胞增殖和死亡的关系。为进一步阐明内膜增生过程中DNA损伤修复对血管平滑肌细胞活性的影响,以构建新的血管损伤标志物,并探索内膜增生和动脉粥样硬化的潜在治疗靶点。方法1.体内实验:七周龄的雄性SD大鼠随机分为两组:正常对照组（对照组,n=10）,球囊损伤组（实验组,n=50）。通过球囊损伤内膜剥脱的方法建立颈动脉损伤内膜增生大鼠模型,实验分组为不同时间点亚组,观察内膜增生的特点,利用HE染色和免疫荧光染色,检测损伤动脉中血管平滑肌细胞增殖特性。通过免疫荧光染色和蛋白免疫印迹法检测DNA双链断裂和同源重组修复相关蛋白的表达情况。为进一步证实DNA修复参与该过程,我们还进行了RT-PCR检测损伤血管Rad51和Brca2蛋白和基因表达情况。2.体外实验:通过用彗星实验和免疫荧光染色,比较并观察小鼠主动脉平滑肌细胞氧化DNA损伤和修复能力。通过激光照射、免疫染色检测小鼠主动脉平滑肌细胞PAR的招募合成过程,同时进行Q-TOF质谱分析和Dot印迹分析,比较不同的细胞系与小鼠主动脉平滑肌细胞PAR的合成量,包括鼠胚胎成纤维细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞等。最后,通过免疫荧光染色和蛋白免疫印迹验证PARP-1和PARG表达,使用PARG抑制剂,观察PARylation依赖的DNA损伤修复和细胞存活情况。结果1.体内实验:球囊损伤后新生内膜持续增生直至损伤后28天,并且能够稳定维持至40天。增生内膜免疫荧光组织化学染色为?-SMA阳性,为血管平滑肌细胞。DNA双链断裂的标记物?H2AX首先发在在损伤部位的血管平滑肌细胞中,随后DNA损伤出现在增生内膜的血管平滑肌细胞,与细胞增殖标记物PCNA保持一致,同时DNA双链断裂的标记物?H2AX与DNA修复蛋白Rad51与损伤标记物共定位于细胞核。二者蛋白表达情况与染色结果一致,均在球囊损伤后出现不断升高情况至28天,此外DNA损伤后,PAR在30分钟内聚集,DNA修复相关基因Rad51和Brca2基因上调,表明激活DNA损伤修复,而在40天左右上述基因表达恢复正常水平。2.体外实验:H2O2处理小鼠主动脉平滑肌细胞较胚胎成纤维细胞更易能够产生氧化DNA损伤甚至DNA双链断裂损伤,表明其对氧化应激刺激更为敏感。DNA损伤相关PARylation在H2O2处理后被激活,通过质谱分析及Dot印迹技术检测出不同细胞系均出现不同程度的PAR合成量增高。然而在血管平滑肌细胞中PARylation水平较其他细胞系低,PARP-1在H2O2处理后处理前后表达未出现变化,表明其原因并非由于缺乏PAR聚合酶PARP-1导致;而PAR水解酶PARG的表达水平明显高于其他细胞系。使用PARG抑制剂处理细胞,观察H2O2处理后PARylation过程表明PAR合成量明显升高,并能够有效激活DNA损伤修复,显著降低DNA双链断裂标记物?H2AX聚集（p<0.05）,增强细胞存活（p<0.05）,防止细胞进一步损伤。结论1.本实验成功制备球囊损伤内膜增生的大鼠模型,制模技术成熟,可用于血管外科相关实验。动脉球囊损伤后新生内膜中的血管平滑肌中存在DNA损伤及修复,血管平滑肌细胞增殖与DNA损伤修复蛋白存在一定相关性,其可能是一种潜在内膜增生的机制参与到动脉粥样硬化和腔内干预的再狭窄过程。DNA损伤相关蛋白可作为检测内膜增生的新的生物标志物指导临床检查,同时激活的DNA修复通路可能是治疗内膜增生的一个潜在途径。2.氧化应激可能通过DNA损伤及修复作用诱导的血管平滑肌细胞生存或死亡。本实验验证了PARylation在DNA修复中的重要作用,PARylation作为一种抗氧化损伤的防御机制,在维持血管平滑肌细胞正常功能起举足轻重的作用。而血管平滑肌细胞中高水平的内源PARG损害细胞修复氧化DNA损伤能力。外源性增加PARG抑制剂通过降低PAR降解过程,促进血管平滑肌细胞PARylation依赖的DNA修复。干预PARylation过程,如通过干扰PARP-1及PARG蛋白表达可能成为临床治疗动脉硬化及内膜增生的潜在靶点,为血管外科疾病的相关治疗提供新思路。