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本文从以下三部分展开论述:
第一部分吗啡后处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用
目的:以吗啡作为处理因素,研究“吗啡后处理”对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响,探讨吗啡后处理所涉及的阿片受体亚型。
材料与方法:应用Langendorff体外灌流装置和大鼠心脏45min全心缺血、60min再灌注损伤模型,于再灌注即刻应用含有吗啡的K-H液进行后处理。首先选用三种浓度吗啡(0.3,3.0和30μM),于三个时间点(5,10和20 min)进行后处理,分别测定吗啡后处理心肌保护作用的量效、时效关系;继而分别将非选择性阿片受体阻断剂naloxone(NAL)、选择性K受体阻断剂nor-binaltorphimine(nor-BNI)和选择性δ受体阻断剂naltrindo1e(NTD)与吗啡联合应用,观察阻断特定阿片受体亚型对吗啡后处理保护作用的影响。记录CF(冠脉流量)、HR(心率)、LVDP(左室发展压)及LVDEP(左室舒张术压)等心脏动力学参数;采用氯化三苯基四氮哗染色法(TTC)进行心肌染色显示心肌梗死面积(IS/AAR);留取灌注液采用ELISA方法进行酶学(CK-MB)测定;记录CF(冠脉流量)、HR(心率)、LVDP(左室发展压)及LVDEP(左室舒张木压)等心脏动力学参数。
结果:
1、三种浓度的吗啡后处理均可显著减少心肌梗死面积(P<0.01)、CK-MB的释放(P<0.01)和改善心功能。(1)3.0μM吗啡显著减少心肌梗死面积(IS/AAR,从58±8%降至37±6%,P<0.01)和CK-MB释放(从67.5±13.3U/h/g降至30.9±5.5U/h/g,P<0.01)。(2)3.0和30μM的吗啡保护作用最明显且此二者之间无显著差异(IS/AAR,37±6% vs.31±7%,P>0.05;CK-MB释放,30.9±5.5U/h/gvs.24.9±8.3U/h/g,P>0.05)。
2、三种后处理时间均可显著减少心肌梗死面积(P<0.01)、CK-MB释放(P<0.01)和改善心功能。(1)吗啡(3.0μM)后处理10min显著减少心肌梗死面积(IS/AAR,从58±8%降至37±6%,P<0.01)和CK-MB释放(从67.5±13.3U/h/g降至30.9±5.5U/h/g,P<0.01)。(2)10min和20 min的后处理时间提供的保护作用最强且此二者之间无显著差异(IS/AAR,37±6% vs.41±7%,P>0.05;CK-MB释放,30.9±5.5U/h/g vs.34.9±8.3U/h/g,P>0.05)。
3、(1)与吗啡后处理组及对照组相比较,NAL完全逆转了吗啡的作用(IS/AAR,37±6% vs.58±7%,P<0.01;CK-MB释放,30.9±5.5U/h/g vs.61.2±10.0%U/h/g,P<0.01);而nor-BNI则部分逆转了吗啡的作用(IS/AAR,37±6%vs.52±5%,P<0.01;CK-MB释放,30.9±5.5U/h/g vs.48.5±5.5 U/h/g,P<0.01);别外,NTD对吗啡后处理的作用却没有影响(IS/AAR,37±6% vs.34±5%,P>0.01; CK-MB释放,30.9±5.5U/h/g vs.25.1±6.0U/h/g,P>0.01)。(2)结果显示三种阿片受体阻断剂分别单独应用时也可提供一定程度的保护作用(P<0.01)。
结论 (1)吗啡后处理为大鼠心肌缺血再灌注损伤提供保护作用且此作用与激活K受体有关。(2)在心肌缺血再灌注损伤过程中,K受体可能扮演着双重的角色:激活或阻断K受体均可提供心肌保护。
第二部分吗啡后处理、吗啡预处理及其二者联合应用心肌保护作用的比较
目的:研究吗啡后处理、吗啡预处理及二者联合应用对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用,并对可能的机理进行探讨。
材料与方法:应用Langendorff体外灌流装置和大鼠心脏45min全心缺血、60min再灌注损伤模型。在恢复灌注的最初10min,采用含3.0μM吗啡的K-H液灌注心脏进行吗啡后处理。全心缺血前10min,先采用含3.0μM吗啡的K-H液灌注心脏20min进行吗啡预处理。首先,分别将吗啡后处理、预处理及二者联合应用的心脏保护效果进行比较;继而,将选择性线粒体ATP敏感钾通道(mito-KATP)阻断剂5-hydroxydecanoate(5-HD)与吗啡合用,观察阻断mito-KATP对吗啡后处理的影响。采用氯化三苯基四氮哗染色法(TTC)进行心肌染色显示心肌梗死面积;留取灌注液采用ELISA方法进行酶学(CK-MB)测定;记录CF(冠脉流量)、HR(心率)、LVDP(左室发展压)及LVDEP(左室舒张末压)等心脏动力学参数。
结果:
1、(1)吗啡后处理、吗啡预处理及二者联合应用均可减少IS/AAR(从58±8%分别降至37±6%、34±5%、36±6%,P<0.01)、CK-MB释放(从67.5±13.3U/h/g分别降至30.9±5.5U/h/g、28.9±4.5U/h/g、30.5±5.0U/h/g,P<0.01)及改善心脏功能,具有显著的心肌保护作用。
(2)吗啡后处理和吗啡预处理表现出相同程度的心肌保护作用(IS/AAR,37±6% vs.34±5%,P>0.01;CK-MB释放,30.9±5.5U/h/g vs.28.9±4.5U/h/g,P>0.01)。
(3)吗啡后处理和吗啡预处理二者联合应用并没有提供更强的保护作用(P>0.01)。
2、(1)与吗啡后处理组及对照组相比较,5-HD部分地逆转吗啡后处理的心肌保护作用(IS/AAR,37±6% vs.51±6%,P<0.01;CK-MB释放,30.9±5.5U/h/gvs.53.5±10.2%U/h/g,P<0.01)。
(2)与对照组相比较,5-HD单独应用亦可显著地降低CK-MB释放(从67.5±13.3U/h/g降至41.7±8.6U/h/g,P<0.01)和IS/AAR(从58±8%降至42±5%,P<0.01)。
结论:
(1)吗啡后处理和预处理联合应用没有协同或者相加作用。(2)吗啡后处理的心肌保护作用可能与mito-KATP通道开放有关,mito-KATP通道可能是二者发挥心肌保护作用的共同通路。
第三部分 PKC及ERK1/2参与吗啡后处理受体后细胞信号传导机制的研究
目的:研究蛋白激酶C(PKC)、PKCε亚型及胞外细胞信号调节激酶(Extracellularsignal-regulated kinase,ERK 1/2)在吗啡后处理受体后细胞信号传导中的作用。
材料与方法:应用Langendorff体外灌流装置和大鼠心脏45min全心缺血、60min再灌注损伤模型。在恢复灌注的最初10min,采用含3.0μM吗啡的K-H液灌注心脏进行吗啡后处理。分别将非选择性PKC阻断剂Chelerythrine、选择性PKCε亚型阻断剂εV1-2及选择性ERK1/2阻断剂PD-98059分别与吗啡合用,观察阻断上述三种激酶对吗啡后处理的影响。采用氯化三苯基四氮唑染色法(TTC)进行心肌染色显示心肌梗死面积;留取灌注液采用ELISA方法进行酶学(CK-MB)测定;记录CF(冠脉流量)、HR(心率)、LVDP(左室发展压)及LVDEP(左室舒张末压)等心脏动力学参数。
结果:
(1)与对照组相比,吗啡后处理显著减少心肌梗死面积(IS/AAR,从58±8%降至37±6%,P<0.01)、CK-MB释放(从67.5±13.3U/h/g降至30.9±5.5U/h/g,P<0.01)及改善心脏功能,具有显著的心肌保护作用。
(2)与吗啡后处理组及对照组相比较,Chelerythrine完全逆转了吗啡的保护作用(IS/AAR,37±6% vs.58±7%,P<0.01;CK-MB释放,30.9±5.5U/h/g vs.60.0±10.0U/h/g,P<0.01)而εV1-2部分逆转了吗啡的保护作用(IS/AAR,37±6% vs.50±5%,P<0.05;CK-MB释放,30.9±5.5U/h/g vs.52.8±6.0 U/h/g,P<0.01)。
(3)与吗啡后处理组及对照组相比较,PD-98059部分地逆转吗啡后处理的心肌保护作用(IS/AAR,37±6% vs.56±8%,P<0.01;CK-MB释放,30.9±5.5U/h/g vs.53.5±10.2U/h/g,P<0.01)。
结论:PKC(尤其是PKCε亚型)及ERK1/2的激活均参与了吗啡后处理受体后细胞信号传导途径。