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卵巢早衰（premature ovarian failure,POF）指年龄小于40岁女性卵巢功能的衰竭,其临床表现为46个月的停经,连续两次且间隔大于4周检测卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone,FSH）>40 IU/L。POF不仅严重影响女性生殖系统功能,同时可增加心血管疾病、骨质疏松、泌尿生殖器官萎缩、认知功能障碍等。据报道,POF发病率约为1%,在中国女性人群中约为2.8%的发病率。因此,及早发现并诊治POF是改善患者生活质量,延缓生殖衰老的重要措施。近年来,为了更好的体现该疾病的发生发展过程,欧洲生殖医学学会（ESHRE）提出了早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency,POI）的概念,将诊断标准中的血清FSH水平降至>25 IU/L。由于本课题中进行基础研究和临床研究的患者样本,均来自近45年间以POF诊断标准（FSH>40 IU/L）纳入的标本库。因此,本文中相关疾病的描述仍以“POF”为主。卵巢早衰的病因复杂,包括遗传学因素,自身免疫性因素,代谢或感染因素,医源性因素等。其中医源性因素主要由手术,放疗或化疗引起的卵巢损伤。放疗对卵巢内各级发育卵泡都有损伤,其中静止原始卵泡对放射线最为敏感。因原始卵泡池内卵泡数量有限且不会再生,原始卵泡的破坏会加速卵巢衰退的发生。本课题第一部分模拟临床放疗过程,通过对国内外放疗模型的改良,利用X射线辐照建立卵巢早衰小鼠模型,为深入探讨有关放疗对卵巢组织损害的机制以及保护女性生育力提供合适的动物模型。POF发病具有较强的遗传基础,有阳性家族史者约占4%30%。我们课题组前期研究发现,HFM1基因突变、ESR1基因多态性可能是特发性POF的易感因素之一,而FST基因的变异,脂联素基因Sinai、BsmI位点的多态性,TBP2基因的突变与中国汉族女性特发性POF的发病无显著相关。但目前发现的众多基因尚不能完全解释POF的发生。最近有研究显示,髓细胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1,MCL-1）是卵巢储备的关键调节因子。通过特异性敲除MCL-1基因的卵母细胞发现,小鼠卵巢储备耗竭加速,以卵泡凋亡激活及原始卵泡池提早耗竭为主要表现。早在2002年英国学者就对MCL-1基因在卵子形成中的作用进行研究,发现MCL-1在生殖细胞发育为原始卵泡,和维持卵母细胞生长发育过程中具有重要作用。另一些研究也发现,MCL-1在动物卵泡发育及闭锁过程中发挥着关键作用。因此,MCL-1基因缺乏可能导致生殖细胞凋亡,参与POF的发生,但目前尚未有文献报道MCL-1基因与中国汉族女性特发性POF的相关关系。本研究第二部分通过直接测序法对中国汉族女性特发性卵巢早衰患者进行MCL-1基因外显子的编码区及其侧翼序列测定,以探讨MCL-1基因与特发性卵巢早衰发生的潜在相关性。通过本课题研究,一方面,应用医源性放疗引起卵巢功能衰退以构建适宜的卵巢早衰动物模型,为临床卵巢早衰疾病的基础研究提供动物模型。另一方面,探讨MCL-1基因与卵巢早衰发病的相关性,为卵巢早衰遗传学病因的研究提供更多理论依据。第一部分放疗致卵巢早衰鼠模型的构建目的:探讨应用放疗建立卵巢早衰小鼠动物模型的方法并验证其可行性。方法:给予8周龄C57BL6雌性小鼠单次全身X射线辐照,按照不同辐照剂量分为0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy组。记录各组放疗后第2天和7天小鼠的体重、卵巢湿重、激素水平、卵泡计数及全身各脏器形态学的变化。观察并分析0 Gy、4 Gy组放疗后2周、3周、4周、6周的上述指标。结果:放疗后第2天和7天,2 Gy、4 Gy及6 Gy组小鼠体重和双侧卵巢湿重均较0 Gy组显著下降。与0 Gy组相比,放疗后2天6 Gy组血清AMH水平明显下降。放疗后7天,4 Gy及6 Gy组血清FSH水平显著升高和AMH水平明显下降,2 Gy、4 Gy及6 Gy组卵巢内原始卵泡数、生长卵泡数均显著下降（P均<0.05）,肝脏、脾脏、子宫内膜均出现了相应组织学改变。与0 Gy组比较,4 Gy组小鼠随着辐照时间延长,卵巢湿重逐渐下降,血清FSH水平逐渐升高,血清E2水平则逐渐降低（P<0.05）;卵巢内原始卵泡数和生长卵泡数逐渐减少至完全耗尽,至6周时卵巢内见大量闭锁卵泡。结论:利用X射线辐照C57BL6雌鼠,4Gy最低适宜剂量于放疗后1周至2周能够成功建立小鼠卵巢早衰模型,且造模时间短、成功率高、死亡率低,为临床卵巢早衰患者的研究提供了可行的动物模型。第二部分特发性卵巢早衰患者MCL-1基因相关性研究目的:探讨髓细胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1,MCL-1）基因与中国汉族女性特发性卵巢早衰（premature ovarian failure,POF）发生的相关性。方法:选择200例中国汉族特发性卵巢早衰患者为POF组和100例月经正常女性为对照组。POF的诊断符合:年龄小于40岁女性,停经46个月,连续2次且间隔大于4周检测血清卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone,FSH）>40 IU/L。收集所有研究对象的外周血标本,对全血样本中的白细胞进行DNA提取。通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）对MCL-1基因外显子的编码区及其侧翼序列进行特异性扩增。通过DNA测序仪对POF组和对照组的PCR产物进行测序分析。应用卡方检验比较突变位点的基因型及等位基因频率在POF组及对照组间的分布情况。结果:本研究结果共发现3处杂合突变:c.-36C>T,c.-131C>T,c.78C>T,位于5’-UTR的c.-36C>T和c.-131C>T在POF组和对照组中均有发现,在POF组中基因型分布分别为c.-36C>T:CC型96.5%（193/200）、CT型3.5%（7/200）、TT型0%（0/200）,c.-131C>T:CC型99%（198/200）、CT型1%（2/200）、TT型0%（0/200）,与对照组相比,基因型和等位基因频率的分布均未见统计学差异（P>0.05）。位于外显子1的同义突变（c.78C>T）仅在1例对照女性中发现,此突变未引起氨基酸的改变（p.Gly26Gly）。结论:MCL-1基因可能与中国汉族女性特发性卵巢早衰的发生无明显相关性。