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实验目的神经分化因子1(NeuroD-1)又名B细胞E盒转录激活因子2(BETA-2),属于组织特异性的B类bHLH蛋白,作为转录因子,NeuroD-1基因是β细胞特异和有效表达胰岛素基因所必需。在基因敲除小鼠的研究中发现【1】,BETA-2基因缺失的小鼠因为β细胞数量的大量减少和缺少适量的胰岛形成,出现严重的糖尿病并在围产期死亡。最近cao【2】等应用基因转染方法将表达PDX-1的基因体外转染肝细胞,结果发现在高糖条件下肝细胞被诱导分泌胰岛素。这就提示,在一定条件下,胰岛素在肝脏的异位表达是可以实现的。本实验拟构建pEGFP-NeuroD表达质粒载体,体外转染肝癌细胞(HepG2),观察HepG2细胞在不同条件下NeuroD-1和胰岛素的表达,从而探讨体外表达NeuroD-1诱导肝癌细胞分泌胰岛素的可能性。实验方法1.以重组质粒Pcr3.1-NeuroD为模板,用PCR方法扩增出NeuroD-1基因,构建入含增强绿色荧光蛋白的表达质粒pEGFP-C1,构建可以表达NeuroD-1基因的质粒载体pEGFP-NeuroD。2.将表达质粒pEGFP-NeuroD用脂质体法转染三种不同葡萄糖浓1【基金项目】:重庆市自然科学基金资助(编号:CSTC2007BB5281)度培养的HepG2细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达;利用RT-PCR方法检测NeuroD-1及胰岛素的表达;用Western Blot检测NeuroD-EGFP融合蛋白的表达。实验结果1.成功构建了pEGFP-NeuroD表达质粒。2.重组质粒体外成功转染入HepG2细胞,在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达,重组质粒转染率在30～40%之间;RT-PCR方法及Western Blot在三种不同葡萄糖浓度培养的HepG2细胞组中均检测到NeuroD-1的表达,其中RT-PCR方法扩增出NeuroD-1 mRNA大小是634bp,NeuroD-EGFP融合蛋白Mr大小67×103,但是三组间基因表达量均无明显差异。3.RT-PCR法未检测到肝癌细胞胰岛素的表达分泌。实验结论1.利用pEGFP-C1带有绿色荧光蛋白序列,为报告基因的特点,构建了表达融合蛋白NeuroD-EGFP的载体。2.pEGFP-NeuroD真核表达载体在肝癌细胞内成功表达融合蛋白NeuroD-EGFP,但是未从肝癌细胞中诱导出胰岛素的表达,功能探讨提示单一NeuroD-1表达质粒的转染可能不足以诱导肝癌细胞分泌胰岛素。