掌握和建立较为成熟的猪胚胎体外生产技术,完善其操作程序、提高猪胚胎生产效率,可以为利用猪体外胚胎进行胚胎干细胞分离培养奠定基础。目前,猪卵母细胞体外成熟、体外受精和孤雌激活等均取得很大进展,但有些方面尚待优化;体外生产获得的胚胎的发育能力,特别是能否利用体外生产的胚胎来分离猪胚胎干细胞还未能取得突破性进展。本研究以屠宰场取得的猪卵巢和养殖场取得的猪新鲜精液为原材料,对猪体外受精、孤雌激活以及孤雌囊胚在饲养层上的发育能力进行部分研究,旨在完善猪胚胎实验室生产体系和探讨孤雌囊胚的后期发育能力,为猪胚胎体外生产和胚胎干细胞分离等相关研究提供参考和依据。实验验结果如下:(1)统计总结了本地区不同月份从屠宰场取得的卵巢,每个卵巢可以获得的有效卵母细胞数;探讨了卵母细胞成熟培养基中促性腺激素PMSG和hCG的不同添加时间对卵母细胞成熟的影响。结果表明,8、9、10和4月份为卵巢采集用于实验的最佳时间;在培养方面,添加促性腺激素组和后22小时不添加促性腺激素组卵母细胞成熟率为80.35±0.76%和82.75±0.85%,差异不显著(P>0.05)。(2)探讨了猪新鲜精液17℃恒温保存时间和精子活力的关系,并用于体外受精后对受精效果的影响。结果发现,精液保存24h以内活力保持在0.9,保存3d的精液活力可以保持在0.7以上,3d后精液活力下降至0.5以下;保存1d以内的猪精液相比于保存4-5d的精液用于体外受精后,受精卵在卵裂率、桑葚胚率以及囊胚率方面差异显著(P<0.05),保存3d以内的猪精液用于体外受精,结果显示受精卵在卵裂率、桑葚胚率以及囊胚率方面差异不显著(P>0.05),保存4-5d的精液用于体外受精后,受精卵在卵裂率、桑葚胚率以及囊胚率方面差异不显著(P>0.05)。(3)探讨了精卵共孵育时间和视磺酸RA对受精卵发育效果的影响。结果表明,精卵共同孵育6h和7h后,受精卵卵裂率为55.90±9.77%和54.51±13.25%,共孵育5 h和8 h卵裂率为52.31±4.84%和53.85±7.16%,差异不显著(P>0.05);但在囊胚率方面,6h组囊胚率为11.89±3.64%,显著差异于5 h和8 h组5.55±0.63%和3.85±2.12%(P<0.05);在成熟液中添加0nM、5nM、25nM和50nM RA后成熟的卵母细胞用于体外受精,结果表明,受精卵在卵裂率、桑葚胚率和囊胚率方面无统计学差异,0nM和5nM组囊胚率要高于25nM组和50nM组。(4)探讨了不同电击参数对体外成熟的卵母细胞孤雌激活后发育的影响。结果表明,激活参数为1.5Kv/㎝,1个DC,100μs时,能有效地激活体外成熟卵母细胞发育至囊胚,显著差异于1.5Kv/㎝/1DC/60μs和1.5Kv/㎝/1DC/80μs组;激活参数为2.0Kv/㎝,1个DC,60μs时,囊胚率为18.70±0.93%,显著差异于2.0Kv/㎝,1个DC,100μs组(P<0.05);而脉冲次数为1个或2个时,对孤雌效果无显著影响。(5)探讨了孤雌囊胚的体外发育能力。结果表明,在含饲养层细胞的培养基中添加小分子物质CHIR99021和PD0325901培养孤雌囊胚,与对照组相比囊胚贴壁率差异不显著(P>0.05);用牛胎儿成纤维细胞CEF作为饲养层细胞培养孤雌囊胚,囊胚贴壁率为33.67±9.84%,显著差异于MEF组19.08±0.52%和PEF组23.47±5.69%(P<0.05),MEF和PEF在支持囊胚细胞贴壁方面差异不显著(P>0.05);用NCSU-23作为培养基培养孤雌囊胚,囊胚贴壁率为22.53±2.46%,显著高于DMEM组的10.41±1.75%和DMEM/NCSU-23组的12.05±2.23%(P<0.05)。综上所述,本地区8、9、10和4月份为卵巢采集用于实验的最佳时间;猪新鲜精液17℃恒温保存3d内精子活力保持在0.7以上,都能很好的用于体外受精;精卵共孵育6h对受精卵发育最好;电击参数1.5Kv/㎝、100μs、1DC或2DC和2.0Kv/㎝、60μs、1DC或2DC时,均能有效地激活体外成熟卵母细胞发育至囊胚;用CEF作为饲养层细胞,NCSU-23作为胚胎培养基,能够支持孤雌囊胚细胞至贴壁。