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禽巴氏杆菌病又称为禽霍乱,是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)引起的一种急性、接触性败血性传染病,对养禽业的发展有着严重的影响。由于Pm血清型众多,寻找新的疫苗抗原,研制新型安全、高效多杀性巴氏杆菌亚单位疫苗尤为重要。6-磷酸葡萄糖脱氢酶(6-PGD)为细菌糖代谢中磷酸戊糖途径的关键酶,在细菌代谢过程中通过调控5-磷酸核糖和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的生成,进而调控细菌的生长与繁殖。通过对多杀性巴氏杆菌C48-1菌株的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的原核表达,初步建立间接ELISA检测方法和重组蛋白免疫保护性的研究。1.参照KEGG中己发表的Pm70菌株的6-PGD基因序列(登录号:T00046),设计引物,以本实验室保存的C48-1菌株的全基因组模板,用PCR的方法成功扩增出6-PGD基因的全序列,该片段长度为1453bp。将目的基因插入原核表达载体PET-28a,成功构建了原核表达质粒PET-28a-6PGD。测序结果表明:扩增序列与GenBank上所报道的Pm70菌株、3480菌株、HN06菌株、ATCC 43137菌株、HB03菌株同源性均达到99%。2.将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达目的蛋白,目的蛋白的大小约为53kD,与预期结果相符。进一步优化诱导时间,并检测目的蛋白在37℃和16℃的可溶性。Western-blot结果表明重组蛋白具有良好的反应原性,为进一步研究其免疫保护功能和间接ELISA方法的初步建立奠定了基础。3.试验应用纯化的6-PGD重组蛋白为包被抗原初步建立间接ELISA检测方法。初步优化间接ELISA最佳反应条件,即抗原包被浓度为10μg/mL,37℃放置2h,4℃过夜,最佳封闭液为5%脱脂奶粉,封闭时间为30min,血清稀释度为1:200,酶标二抗按1:60000稀释,血清和酶标二抗的孵育时间分别为30min和60min,批间重复和批内重复实验的变异系数均在0.433%-7.23%,阻断试验的阻断率均大于50%。4.将纯化后的重组蛋白和C48-1灭活全菌用白油佐剂制成疫苗免疫鸡,同时设生理盐水为阴性对照组。免疫两次,间隔时间为两周,用间接ELISA方法检测血清抗体水平。结果表明重组蛋白组的抗体水平明显高于全菌灭活苗组和对照组。首免后第7周C48-1强毒株以10LD50攻毒,结果显示:全菌灭活苗组能够提供100%的保护,重组蛋白组保护率为60%,生理盐水组则完全没有保护力。综上所述:建立的间接ELISA方法可用于临床样品检测,为巴氏杆菌病流行病学的调查和下一步ELISA检测试剂盒的开发奠定了基础。重组蛋白能够诱导鸡产生较高水平的特异性抗体,且具有一定的免疫保护作用,为进一步研究6-PGD的致病机理以及亚单位疫苗的研究奠定了基础。