神经系统肿瘤疾病中胶质瘤的发病率最高,约占40～50%。尽管临床的综合治疗方案能产生一些疗效,但胶质瘤的预后仍然很差。基因治疗的出现为我们展示了良好的前景。但由于病毒载体自身毒性、目的基因表达周期短、靶向性问题、免疫源性或者不能选择到合适的追踪浸润瘤细胞载体等原因,在I期和II期临床试验都未能取得预期的疗效。骨髓基质干细胞作为一种新型的载体出现引起了科学工作者的关注,它培养方法简单成熟,具有多向分化潜能和定向迁移能力,而且外源性基因表达稳定,来源安全可靠,没有伦理学困扰,因此能够选作为种子细胞进行靶向治疗。骨髓基质干细胞的分离培养鉴定分化等生物学特性研究是各项干细胞实验的基础,也是研究的热点和难点。在体内干细胞向神经元方向分化的比例相当低。这就需要给予合适的诱导策略增加其神经方向的分化率。碱性成纤维细胞生长因子的诱导血管生成,促进有丝分裂等生物学作用较显著。体内研究中由于外源性因子的导入困难,而应激条件下被激活的内源性碱性成纤维细胞生长因子表达有限,所以骨髓基质干细胞分化为神经细胞修复整合受伤的神经网络的功能有限,因此将相关基因导入骨髓基质干细胞使其能够持续稳定的表达有助于神经系统损伤的治疗。骨髓基质干细胞能够选择性趋向体内各损伤部位,他的这种归巢性被认为是其发挥肿瘤治疗作用的重要基础。而且骨髓基质干细胞能够通过多种机制治疗脑肿瘤。骨髓基质干细胞体外所处环境与体内微环境不同,目前在体外模拟体内环境条件下干细胞对胶质瘤细胞趋向效应的研究较少。考虑到未来临床使用的可操作性问题,应该选择经何种途径移植干细胞治疗胶质瘤才能达到最大效果。在脑胶质瘤的发生发展的病理过程中常有一些相关特异性因子参与,这些因子的表达变化可以作为胶质瘤治疗效果的评估指标。葡萄糖转运蛋白-3被认为是脑恶性肿瘤糖代谢的第一个限速因子,缺氧诱导因子-1α是恶性肿瘤参与肿瘤血管生成、肿瘤细胞代谢、凋亡的重要核转录因子。目前对这几种因子在中枢神经系统肿瘤中的共同表达研究甚少。基于此,我们进行以下研究。第一部分骨髓间充质干细胞的生物学特性研究目的:研究骨髓间充质干细胞的生物学特性。方法:对BMSCs进行体外分离培养诱导分化,并免疫组化,流式细胞术,免疫荧光鉴定。构建bFGF过表达载体并测序,慢病毒包装后转染BMSCs,分别在体外体内通过形态学,免疫组化,免疫荧光,western blot,PCR,观察bFGF基因修饰后的骨髓基质干细胞增殖、分化及迁移效应的情况。结果:BMSCs分离接种24h后,可见细胞贴壁,3d以后,进入细胞对数生长期。1W左右,可观察到细胞逐渐增多并形成突起相互联系,生长速度减慢。培养12d后,细胞达到融合成片铺满瓶底。实验组细胞数量与未经诱导组相比有显著统计学差异(P<0.05);免疫细胞化学方法检测发现CD44,CD29,CD90,CD105染色的细胞胞浆呈现棕黄色。CD44阳性细胞率为92.0±3.2%,CD29阳性细胞率为94.6±4.8%,而CD45,CD11b,CD34染色的细胞胞内几乎没有表达;流式细胞术检测细胞表面标记可见CD90为99.64%,CD34为1.23%,CD44为99.54%,CD11b为0.43%;BMSCs经诱导分化3d后表达Nestin抗原,7d后细胞表现出典型的神经元样改变,检测到来源于BMSCS的部分细胞可分别表达NeuN和GFAP。NSE、NeuN、GFAP免疫反应阳性细胞的比例在培养的早期随时间延长而逐渐增多。但到1W后,比例逐渐降低。经诱导的组别的NeuN阳性细胞明显多于对照组(P<0.05)。载体构建和病毒包装实验中,筛选酶切后得到pUC57-SL08重组质粒酶切后的SL08片段。将SL08片段克隆入pLenti6/V5-D-TOPO得到pLenti6-SL08重组质粒,对重组质粒进行测序,鉴定成功构建bFGF的过表达载体,慢病毒滴度定量测得为3×107v.p./ml。pLenti6-SL08转染大鼠骨髓基质干细胞48 h后,通过Western blot与RT-PCR检结果发现各组均有bFGF基因的表达,bFGF基因修饰的BMSCs组中bFGF表达效果最明显。体外培养实验中,基因转染后BMSCs各组细胞24小时后细胞数量开始增加,48至72小时后,细胞数量均显著增多,pLenti6-SL08组细胞数量多于其他两组,但各组间数量无显著差异(P>0.05),7天左右均可见有明显神经元样改变细胞出现,此时三组细胞数量增长均显著放缓,但是pLenti6-SL08组细胞数量显著多于其他两组(P<0.05),其他两组间细胞数无明显差异(P>0.05)。流式细胞术结果显示,pLenti6-SL08组CD90 96.44%,CD34 0.61%,BMSCs-2组CD44 99.95%, CD11b0.73%。细胞体外培养到一周后,3组细胞均见大部分细胞出现明显神经元样改变。pLenti6-SL08组神经元样改变细胞数量与其他两组比有显著差异(P<0.05)。pLenti6-SL08载体转染大鼠骨髓基质干细胞48 h后,通过Western blot与RT-PCR检测bFGF表达,证明经bFGF修饰的骨髓基质干细胞组的bFGF基因表达明显强于其他两组,转染结果可靠。培养7天后免疫细胞组织化学方法发现三组细胞中均可见Nestin, NeuN, GFAP的表达。pLenti6-SL08组细胞的Nestin, NeuN表达显著多于其他两组(P<0.05)。Western blot检测pLenti6-SL08组Nestin, NeuN均显著高于其他两组(P<0.05),而其他两组间Nestin, NeuN的表达无明显差异(P>0.05)。脑创伤体内模型中,免疫组织化学结果显示:各时间点损伤侧BrdU阳性细胞多于对侧(P <0.001),而且经bFGF修饰BMSCs组在各时间点阳性细胞均多于未经修饰组(P <0.001);1W后所检出的BrdU阳性细胞开始减少,但在损伤同侧部位bFGF修饰BMSCs组降低幅度要小的多(P =0.08)。Western blot检测各组脑组织不同时间点bFGF的表达情况发现实验组,对照组不同时间点bFGF表达有显著差异(P<0.05)。实验组bFGF7d时明显增高(P<0.05),14d时虽下降但无统计差异(P =0.12);对照组bFGF7d时明显增高(P<0.05),14d时显著下降(P<0.05) ;各时间点bFGF在实验组表达强于对照组(P<0.05)。免疫荧光双标实验中发现两组干细胞移植到脑内后均可以表达干细胞标记的BrdU,并且同样能够分化为神经元和神经胶质细胞,但分化为神经胶质细胞的比例远大于神经元。同侧脑室、皮质区域可见BMSCs组和bFGF修饰BMSCs组均有大量BMSCs分布,两组间有显著差异(P<0.05);在同侧脑室、皮质区域可见bFGF修饰BMSCs组干细胞分化为神经元显著多于BMSCs组(P<0.05)。结论:骨髓基质干细胞体外分离培养可以得到高纯度的骨髓基质干细胞,bFGF修饰的骨髓基质干细胞在体内外均能稳定持续地增殖和神经细胞方向的分化,而且能更显著地向脑外伤后的损伤部位迁移。第二部分骨髓基质干细胞对胶质瘤细胞的趋向效应目的:研究骨髓基质干细胞在体外和体内向胶质瘤细胞的趋向及对胶质瘤细胞的抑制效应。方法:通过免疫组化,Western blot评估GLUT-3、HIF-1α是否可作为评估胶质瘤生物学行为的指标之一。然后模拟体内环境,采用Transwell、MTT、平板克隆等方法观察预处理的BMSCs对胶质瘤细胞的趋向、抑制等方面效应,然后构建大鼠C6胶质瘤模型,经不同途径移植BMSCs,通过行为学,形态学,组织病理学,分子生物学等方法观察BMSCs对胶质瘤细胞的趋向、抑制效应。结果:免疫组化方法检测发现GLUT-3、HIF-1α其表达强度随胶质瘤的病理分级增加而升高(P<0.001)。western blot检测两者的表达与免疫组化结果相似。体外实验部分:我们观察到C6细胞生长迅速,传代后细胞增殖速度依然很快。在Transwell共培养体系中预处理和未经预处理的BMSCs分别与C6胶质瘤细胞共培养,HE染色方法发现两组小室内膜上均有大量细胞通过,实验组通过小孔的细胞数量多于对照组(P<0.001)。MTT结果显示用含有普通骨髓基质干细胞上清液培养的C6细胞生长增殖速度明显高于预诱导骨髓基质干细胞上清液培养的C6细胞组(P<0.05)。平板克隆实验结果显示,对照组上清液培养的C6细胞形成的克隆数多于实验组(P<0.05)。这两组用Western blot检测发现预处理骨髓基质干细胞培养液组GLUT-3和HIF1α表达明显被抑制(P<0.05)。体内实验:发现对照组最早出现颅内压增高症状症状,且很快加重,BMSC-1组最晚出现以上症状。对照组第3天时即开始出现死亡病例,BMSC-1组存活时间最长为45天,各组生存率有显著差异(P<0.05)。HE发现胶质瘤细胞十分密集,向正常脑组织浸润,正常组织区别明显,细胞小核大,多见核分裂相,有明显的癌巢。对照组肿瘤体积最大,经脑室组最小(P<0.05)。BrdU免疫组化染色结果显示:骨髓基质干细胞在通过侧脑室移植入鼠脑胶质瘤模型后,干细胞在脑室周围,血管和海马等处分布较明显,主要集中在胶质瘤的边缘部位或与临近组织处交接范围。肿瘤同侧半球中的表达高于肿瘤内部表达(P <0.001)。同侧半球分布明显多于对侧半球分布(P <0.001)。经尾静脉途径移植组发现BrdU阳性细胞主要集中在肿瘤所在半球的血管和肿瘤周边,在肿瘤内、脑室附近及对侧半球极少,肿瘤同侧半球中的表达多于肿瘤内部表达(P <0.001),同侧半球分布明显多于对侧半球分布(P <0.001)。两组相比较,经侧脑室移植途径肿瘤内部BrdU阳性细胞多于尾静脉途径移植组(P <0.001)在肿瘤同侧半球的阳性细胞也明显多于尾静脉途径移植组(P <0.001),对侧半球阳性细胞也多于尾静脉组(P <0.001)。Western blot检测显示在BMSCs-1、BMSCs-2组及对照组中GLUT-3,HIF1α的表达分别成递增趋势(P<0.05)。RT-PCR检测与Western blot相似, GLUT-3和HIF1α的表达也均成递增趋势(P<0.05)。结论:初步证实了GLUT-3和HIF1α是参与胶质瘤发病机制的重要因子,在体外经预诱导处理的骨髓间充质干细胞对胶质瘤细胞的趋向性更强,可抑制脑胶质瘤细胞的增殖,降低GLUT-3和HIF1α的表达,体内经脑室移植途径干细胞能更多地向胶质瘤迁移,能明显抑制瘤体增大,降低GLUT-3和HIF1α的表达和改善预后。