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多角体启动子在杆状病毒表达系统中被广泛应用,因其具有高效启动外源基因表达的能力,但是其调控机制迄今为止还尚阐明。因此,在本研究中以家蚕杆状病毒(Bm NPV)多角体基因polh启动子为研究对象,利用酵母单杂交技术筛选与多角体启动子序列相结合的蛋白因子,并对筛选蛋白因子的功能进行了研究。首先提取感染了Bm NPV的家蚕Bm N细胞内总RNA,逆转录为c DNA,构建基因表达文库。然后,利用酵母单杂交系统筛选与多角体启动子序列结合的蛋白。通过筛选、测序,共鉴定出18个能与polh启动子序列相互作用的蛋白。通过生物信息学分析,挑选了3个基因(lef5、orf61和p6.9)作进一步研究。为验证筛选出基因的功能,分别将原核表达并纯化的三种蛋白:lef5、orf61和p6.9进行EMSA分析,结果表明,orf61能与polh的启动子序列相互作用。为了进一步鉴定三种蛋白的功能,利用瞬时表达系统,构建lef5、orf61和p6.9的瞬时表达载体,转染病毒Bacimd-Luc感染的Bm N细胞,定量检测报告基因Luc的表达情况。结果显示lef5、orf61和p6.9均对polh启动子具有正调控作用。然后,又利用基因敲除技术,进一步研究了3个基因的功能。通过Red重组技术构建了基因敲除型病毒lef5-ko-Bacmid、orf61-ko-Bacmid和p6.9-ko-Bacmid,通过Bac-to-Bac系统构建了补回型病毒lef5-re-Bacmid、orf61-re-Bacmid和p6.9-re-Bacmid,然后将构建的病毒分别转染家蚕Bm N细胞。研究发现lef5、orf61和p6.9缺失型病毒TCID50均为0,修复型病毒与野生型病毒TCID50无明显差异(p>0.05),说明3种基因缺失均导致不能形成有感染活性的病毒粒子(BV)。其中,orf61缺失型对病毒基因组复制有显著影响(p<0.05),lef5和p6.9没有明显影响(p>0.05),说明orf61可能是病毒基因组复制的必需基因。此外,为了了解3种基因的缺失对Bm NPV其他基因表达的影响,选取了病毒早期基因lef3、晚期基因vp39和极晚期基因p10进行荧光定量PCR分析,实验结果表明,3种基因的缺失,均会对病毒的早期、晚期和极晚期基因的转录水平有显著影响(p<0.05)。综上所述,利用酵母单杂交技术筛选获得的lef5、orf61和p6.9,其中证明ORF61蛋白可与Bm NPV polh启动子序列相结合,它们的表达水平可直接影响polh的启动和表达水平;此外,3种基因对Bm NPV的早期、晚期和极晚期基因的转录水平也有显著影响。本研究工作将为阐明杆状病毒表达系统的高效表达机制和病毒载体系统的改造奠定基础。