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目的:本实验拟1、研究肝癌组织、癌旁组织和良性肝组织中TMEM16A蛋白水平的表达差异,在肝癌组织和癌旁组织中研究TMEM16Am RNA水平表达差异;2、在肝癌细胞系SMMC-7721中转入TMEM16A过表达质粒并研究TMEM16A过表达对肝脏肿瘤细胞的增殖能力、迁移能力和凋亡能力的影响。3、研究肝癌组织和癌旁组织的TMEM16A基因启动子Cp G岛甲基化程度并在SMMC-7721中研究去甲基化药物5-氮杂-2脱氧胞苷处理对TMEM16A蛋白表达水平和TMEM16Am RNA表达水平的影响。方法:1、本课题收集青岛大学附属医院肝胆胰外科40例肝癌切除术患者的肝癌组织及其癌旁组织40对和6例肝良性病变,利用western blot方法研究TMEM16A蛋白在肝癌组织、癌旁组织和肝脏良性组织中的表达水平,利用实时荧光定量PCR方法研究TMEM16Am RNA在肝癌组织和癌旁组织中表达水平;2、通过在肝癌细胞系SMMC-7721中转入TMEM16A过表达质粒p EGFP-TMEM16A和pc DNA3.1-TMEM16A和相应对照空载p EGFP-N1和pc DNA3.1,使用MTT比色法、划痕实验法和A nnexin V&PI双染凋亡检测法,研究TMEM16A过表达质粒对肝肿瘤细胞SMMC-7721增殖能力、迁移能力及细胞凋亡的影响;3、用亚硫酸氢盐克隆测序法(Bisul fite Sequence PCR,BSP)检测肝癌组织和癌旁组织TMEM16A基因启动子Cp G岛甲基化程度差异,并使用甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2脱氧胞苷处理SMMC-7721细胞,并使用实时荧光定量PCR检测处理造成的TMEM16Am RNA变化差异,用wes tern blot检测处理造成的TMEM16A蛋白变化差异以及用亚硫酸氢盐克隆测序法检测TMEM16A基因启动子Cp G岛甲基化程度差异。结果:本研究第一次证实:1、通过western blot结果显示肝癌中TMEM16A蛋白表达水平相比于癌旁组织(P<0.01)和良性肝组织(P<0.001)明显低表达,实时荧光定量PCR结果显示肝癌中TMEM16Am RNA表达水平相比于癌旁组织明显低表达(P<0.001);2、通过在肝癌细胞系SMMC-7721中转入过表达质粒p EGFP-TME M16A和相应空载p EGFP-N1,并利用荧光显微镜拍照和异常细胞分析显示TMEM16A在肝癌细胞中的过表达明显提高了异常细胞百分比(P<0.001);3、通过在肝癌细胞系SMMC-7721中转入TMEM16A的过表达质粒并通过MTT细胞增殖实验、划痕实验和Annexin V&PI双染凋亡检测可以发现,TMEM16A的过表达明显抑制了肿瘤细胞的增殖能力(P<0.001),并促进细胞凋亡(P<0.05),但是对肿瘤细胞的迁移能力并无明显影响。4、亚硫酸氢盐克隆测序实验结果证实相比于癌旁组织TMEM16A基因启动子Cp G岛甲基化水平在肝癌组织中处于更高水平(P<0.05)。并且,相比于对照组的肿瘤细胞经过去甲基化5-氮杂-2脱氧胞苷处理的SMMC-7721肿瘤细胞的TMEM16A基因启动子Cp G岛甲基化程度明显下降(P<0.05),并且通过western blot和实时荧光定量PCR检测发现TMEM16A的蛋白和m RNA(P<0.05)水平表达明显提高。结论:肝癌组织中的TMEM16A低表达与其基因启动子的高甲基化状态有关;TME M16A可能通过凋亡机制影响肝癌细胞系SMMC-7721的增殖。