[目的]研究金葡菌及其菌壁蛋白SpA、PGN、LTA对破骨细胞分化形成及骨吸收的作用,并探讨金葡菌、SpA、PGN、LTA促进破骨细胞分化形成的相关分子机制。[方法]1.MTT试验,将RAW264.7细胞种植于96孔细胞培养板,以不同感染复数的金葡菌活菌(5-40:1)、灭活菌(10-40:1),以及不同浓度的金葡菌滤液(5-20μg/ml)、SpA(50-1600ng/ml)、PGN(100-400ng/ml)、LTA(100-400ng/ml)作用于RAW264.7细胞,分别培养1、3、5天。在对应时间点,对相应的96孔板进行MTT试验,检测各刺激物对RAW264.7细胞增殖活性的影响。2.抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP染色),将RAW264.7细胞种植于96孔细胞培养板,以不同感染复数的金葡菌活菌(5-40:1)、灭活菌(10-40:1),以及不同浓度的金葡菌滤液(5-20μg/ml)、SpA(50-800ng/ml)、PGN(100-400ng/ml)、LTA(100-400ng/ml)作用于RAW264.7细胞,在各刺激物作用后的第5天,对各实验组的96孔板进行TRAP染色,检测各实验组破骨样细胞的形成情况,并计数每孔破骨样细胞的数目。为研究NF-κB信号通路的作用,在各刺激物加入前1小时加入20μM的NF-κB转录活性抑制剂JSH-23,JSH-23共作用25小时后撤出,重复该部分实验。3.骨吸收凹陷实验,将RAW264.7细胞种植于24孔COAS骨吸收活性检测板上,以不同感染复数的金葡菌活菌(5-40:1)、灭活菌(10-40:1),以及不同浓度的金葡菌滤液(5-20μg/ml)、SpA(50-800ng/ml)、PGN(100-400ng/ml)、LTA(100-400ng/ml)作用于 RAW264.7 细胞,在各刺激物作用后的第5天,移除各实验组24孔COAS板内的培养基及细胞,检测各实验组骨吸收凹陷的形成情况,并在200倍镜的视野下,用软件计算各实验组骨吸收凹陷的累积面积占该视野面积的比值。为研究NF-κB信号通路的作用,在各刺激物加入前1小时加入20μM的JSH-23,重复该部分实验。4.实时荧光定量PCR(RT-PCR)实验,将RAW264.7细胞种植于6孔细胞培养板上,以不同感染复数的金葡菌活菌(5-40:1)、灭活菌(10-40:1),以及不同浓度的金葡菌滤液(5-20μg/ml)、SpA(50-800ng/ml)作用于RAW264.7细胞,在各刺激物作用后的第5天,使用RT-PCR检测破骨细胞标志性基因TRAP、MMP-9、cathepsin K、calcitonin receptors、Atp6v0d2的表达情况。为研究NF-κB信号通路的作用,在各刺激物加入前1小时加入20μM的JSH-23,重复该项实验。5.Western blot实验,将RAW264.7细胞传代培养于25cm2的细胞培养瓶内,待细胞生长并铺满瓶底约80%时,换液后分别以感染复数为20:1的金葡菌活菌、浓度为400ng/ml的SpA、200ng/ml 的 PGN 及 LTA,作用于 RAW264.7 细胞 0、5、10、20、40 及60分钟,在预定时间点收集细胞,通过westerrn blot方法检测ERK1/2、p38、JNK、NF-κB p65、IκB-α、Akt及其磷酸化蛋白的表达情况。为进行NFATc1的检测,将RAW264.7细胞接种于6孔细胞培养板,然后使用金葡菌、SpA、PGN及LTA对其进行诱导培养,金葡菌活菌感染RAW264.7细胞24小时后撤出,而400ng/ml的SpA、200ng/ml的PGN及LTA则持续作用于RAW264.7细胞,细胞分别培养0、1、2及3天,在对应时间点收集细胞,通过westernblot检测NFATcl的表达情况。为研究NF-κB与NFATc1的关系,在各刺激物加入前1小时加入20μM的JSH-23,重复该部分实验。6.酶联免疫吸附法(ELISA)实验,将RAW264.7细胞接种于24孔细胞培养板上,以感染复数为5-40:1的金葡菌活菌、50-800ng/ml的SpA、100-400ng/ml的PGN及LTA作用于RAW264.7细胞,细胞分别培养1、2、3天,在预定时间点收集上清液,通过ELISA检测IL-6、IL-1α及TNF-α的表达情况。[结果]1.MTT实验结果:金葡菌活菌在感染复数为5:1及10:1时,其对RAW264.7细胞的增殖活性无影响,在感染复数为20:1及40:1时,其抑制了RAW264.7细胞的增殖活性。SpA作用于RAW264.7细胞的第一天,在100-400ng/ml的浓度下,SpA促进了 RAW264.7细胞的增殖,在50及800ng/ml的浓度下,SpA对RAW264.7细胞的增殖活性无影响,但在1600ng/ml的浓度下,SpA抑制了 RAW264.7细胞的增殖;SpA作用于RAW264.7细胞的第3及第5天,在50-800ng/ml的浓度下,SpA对RAW264.7细胞的增殖活性无影响,但在1600ng/ml的浓度下,SpA抑制了 RAW264.7细胞的增殖。实验所用感染复数下的金葡菌灭活菌,以及实验所用浓度下的金葡菌滤液、PGN、LTA,对RAW264.7细胞的增殖活性无影响。2.TRAP染色结果,金葡菌活菌、灭活菌、金葡菌滤液、SpA、PGN及LTA均以剂量依赖的方式促进了破骨样细胞的形成,随上述刺激物剂量的逐步增加,破骨样细胞的形成数目逐渐增加。但在加入JSH-23后,上述各实验组破骨样细胞的形成数目明显降低,与相同剂量下未加入JSH-23的组比较,差异均有统计学意义。此外,在RANKL的存在下,SpA诱导形成的破骨细胞的数目明显增加,均高于相同浓度下未加入RANKL组所形成的数目。3.骨吸收凹陷实验结果,金葡菌活菌、灭活菌、金葡菌滤液、SpA、PGN及LTA均以剂量依赖的方式促进了骨吸收凹陷的形成,随上述刺激物剂量的逐步增加,骨吸收凹陷的面积逐渐增加。但在加入JSH-23后,上述各实验组骨吸收凹陷的面积明显降低,与相同剂量下未加入JSH-23的组比较,差异均有统计学意义。此外,在RANKL的存在下,SpA诱导形成的骨吸收凹陷的面积明显增加,均高于相同浓度下未加入RANKL组所形成的面积。4.PT-PCR实验结果,金葡菌活菌、灭活菌、金葡菌滤液及SpA均以剂量依赖的方式促进了破骨细胞标志性基因TRAP、MMP-9、cathepsin K、calcitonin receptors、Atp6v0d2 的表达增高,随上述刺激物作用剂量的逐步增加,破骨细胞标志性基因的表达逐渐增高。但在加入JSH-23后,上述各实验组破骨细胞标志性基因的表达均明显降低,与相同剂量下未加入JSH-23的组比较,差异均有统计学意义。此外,在RANKL的存在下,SpA诱导的破骨细胞标志性基因的表达,均高于相同浓度下未加入RANKL组所诱导的表达。5.Westem blot实验结果,在金葡菌活菌或SpA的作用下,IκB-α在其作用后的10min时表达明显降低,而磷酸化的NF-κB p65在5min及10min时表达增高。在PGN的作用下,IκB-α的表达在5min及lOmin时明显降低,而磷酸化的NF-κB p65在5min及10min时表达增高。在LTA的作用下,IκB-α的表达在5min及10min时降低,10min时降低更明显,而磷酸化的NF-κB p65在10min时表达明显增高。ERK1/2、p38、JNK、Akt及其磷酸化蛋白的表达,在金葡菌、SpA、PGN及LTA的作用下无明显变化。NFATcl的表达在金葡菌、SpA、PGN及LTA作用后的第2及第3天的表达逐渐增高,但加入JSH-23后,NFATc1在第2及第3天的表达明显低于未加入JSH-23时的表达。6.ELISA实验结果,在金葡菌感染下,IL-6、IL-1α及TNF-α在第2及第3天的表达,随金葡菌感染复数的增加及培养时间的延长,其表达逐渐增高。在SpA、PGN及LTA的作用下,IL-6在第2及第3天的表达随SpA、PGN及LTA浓度的增加及培养时间的延长,其表达逐渐增高,但IL-lα及TNF-α无明显表达。[结论]1.金葡菌具有促进破骨细胞分化形成及促进骨吸收的作用,该作用是金葡菌的菌壁成分及其分泌的活性分子的共同作用。2.金葡菌的菌壁蛋白SpA、PGN及LTA同样具有促进破骨细胞分化形成及促进骨吸收的作用。3.NF-κB信号通路在金葡菌、SpA、PGN及LTA诱导的破骨细胞的分化形成及骨吸收过程中起重要作用。