论文部分内容阅读
纤毛(Cilia)是一种突出于细胞表面主要由细胞微管组成的亚细胞结构。它可以调节细胞运动,还可作为细胞感受器,介导多种信号通路(Wnt、Hedgehog和PDGFR等),参与调节细胞的生长分化等多种生命活动。纤毛的结构和功能异常导致纤毛相关疾病的发生。结肠腺瘤息肉蛋白(Adenomatous polyposis coli, APC)是一个肿瘤抑制因子。APC突变与家族性结肠腺瘤息肉病(Familial adenomatous polyposis,FAP)和Gardner综合征的发生有关。Gardner综合征是FAP的一个变体,它的肠外病变被报道是与纤毛异常相关的疾病,而APC突变是其发病的分子基础。但目前国内外关于APC和纤毛之间的相关性及APC突变导致纤毛异常的机制尚不清楚。本研究主要对APC的N端功能区与纤毛生长之间的关系进行研究。研究内容包括以下三部分：第一部分：APC及其N端功能区对细胞纤毛生长的影响。分别利用western blotting和免疫荧光技术检测NIH3T3细胞中,APC在纤毛生长过程中的表达变化及其在纤毛的定位情况。将含有APC, APC-N, APC-M和APC-C的重组质粒转染入NIH3T3细胞中,观察它们对纤毛生长的影响；分别利用NIH3T3和MDCK细胞为模型,重点研究ACPN端的三个片段(APC-N1, ACP-N2和APC-N3)对细胞纤毛生长的影响。结果表明APC在NIH3T3细胞纤毛的生长过程中表达上调并且定位于纤毛的基体。APC的N端片段APC-N1, APC-N2和APC-N3(分别包含APC的氨基酸序列1-1018,1019-2038和2039-2843)的表达不同程度的抑制纤毛组装,其中APC-N2对纤毛形成的抑制影响最大,APC-N3和APC-N1次之。第二部分：APC的N端功能区抑制纤毛生长的机制研究。在上述实验中我们发现APC的N端片段抑制纤毛的形成,本实验从以下几方面对它们抑制纤毛形成的机制进行深入研究：1,APC的N端功能区中的三个片段APC-N1, APC-N2和APC-N3过量表达对纤毛相关蛋白GSK-3β的影响。2,APC-N1, APC-N2和APC-N3在纤毛中的定位情况；3,APC-N1, APC-N2和APC-N3过量表达对基体组成蛋白γ-tubulin和pericentrin的影响；4,APC-N1, APC-N2和APC-N3过量表达对acetylated tubulin的影响；5,APC-N1, APC-N2和APC-N3过量表达对细胞周期进展的影响。结果发现(1)APC的N端片段通过激活P13K/AKT信号通路,进而抑制GSK3β的活性,使得纤毛形成受到抑制；(2)尽管APC的N端三个片段都抑制纤毛的形成,但是它们在纤毛基体中的定位是不同的：APC-N1定位于基体,而APC-N2和部分APC-N3不存在于基体；(3)APC-N2和APC-N3降低了细胞内y-tubulin的蛋白表达量,这可能导致纤毛受损；(4)过表达APC-N2降低细胞acetylated tubulin的表达,用抑制剂TSA处理后acetylated tubulin的表达量和纤毛生长率都上升,表明APC-N2通过影响微管蛋白的乙酰化抑制纤毛的形成；(5)APC的N端片段不是通过扰乱细胞周期进展来抑制纤毛形成。第三部分：APC的N端功能区对纤毛相关信号通路Wnt,Hedgehog和PDGFR的影响。本部分实验主要是通过western blotting检测APC的N端三个片段的过量表达对纤毛相关信号通路Wnt,Hedgehog和PDGFR中重要组成成员蛋白表达水平的影响。结果表明APC的N端三个片段过量表达后,Wnt信号通路中β-catenin的表达升高；Hedgehog信号通路中Glil表达上升,Gli3-R表达下降；PDGFR信号通路PDGFRa及下游效应分子p-AKT和p-ERK1/2表达上升。这些结果表明APC的N端片段过量表达激活纤毛相关的Wnt,Hedgehog和PDGFR通路。