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目的:改进大鼠AEC-Ⅱ细胞的分离方法,并对AEC-Ⅱ细胞体外培养方法进行改良,探索一种体外培养时能有效维持AEC-Ⅱ细胞表型的方法。方法:经气管持续注入0.25%胰蛋白酶和0.1%I型胶原酶消化大鼠肺组织获取大鼠AEC-Ⅱ细胞,大鼠IgG免疫粘附法、差异贴壁法提纯细胞,台盼蓝染色和流式细胞术检测细胞活力,双标免疫荧光法、透射电镜技术鉴定细胞。分离、提纯后的随机细胞分为A组(SAGM+1%FBS培养)、B组(SAGM+10%FBS培养)、C组(DMEM+1%FBS培养)、D组(DMEM+10%FBS培养)4组,分别予以不同培养基联合不同浓度的血清进行培养,于培养后的第8、10、12天收集细胞,Real-time PCR检测SP-A、SP-B、SP-C的表达以评估肺泡Ⅱ型上皮细胞表型维持情况。结果:持续气管内注入消化酶分离大鼠AEC-Ⅱ细胞,经纯化后可获得细胞产量达2×10~7-5×10~7/ml,经台盼蓝染色检测细胞活力达(91±1.7)%,流式细胞术检测细胞活力达(90.3±1.2)%,经SP-C免疫荧光染色评估细胞纯度可达(90±1.2)%。为了研究AEC-Ⅱ细胞表型维持情况,Real-time PCR检测四组细胞SP-A、SP-B、SP-C的相对表达量:(1)培养至第8天时,与A组细胞相比,B组、C组细胞表达三种物质的量明显减少,p<0.05,差异有统计学意义,与B组、C组细胞比较,D组细胞表达三种物质的量明显下降p<0.05,差异有统计学意义;(2)培养至第10天时,与A组细胞相比,B组、C组细胞表达三种物质的量明显减少,p<0.05,差异有统计学意义,与B组、C组细胞比较,D组细胞表达三种物质的量明显下降p<0.05,差异有统计学意义;(3)培养至第12天时,与A组细胞相比,B组、C组细胞表达三种物质的量明显减少,p<0.05,差异有统计学意义,与B组、C组细胞比较,D组细胞表达三种物质的量明显下降p<0.05,差异有统计学意义。结论:1.持续气管内注入消化酶分离大鼠AEC-Ⅱ细胞能有效提高消化效率。2.SAGM+1%FBS体外培养大鼠AEC-Ⅱ细胞时能较长时间维持其表型。