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目的体内外分别检测NANOG基因在不同病理级别胶质瘤组织和U87胶质瘤细胞系中的表达,探讨NANOG基因在胶质瘤生物学行为中的作用,并构建NANOG慢病毒RNAi载体,为后续进一步体内外研究干扰NANOG基因表达对胶质瘤细胞生物学活性的影响奠定基础。方法(1)采用免疫组织化学染色法、Western blot和RT-PCR方法从蛋白和mRNA水平检测50例不同病理级别胶质瘤组织和7例正常脑组织标本中NANOG的表达。(2)无血清悬浮培养法从U87胶质瘤细胞系分离培养BTSCs,采用单克隆形成实验纯化BTSCs,观察BTSCs在体外的增殖和分化,通过免疫细胞荧光染色法鉴定其干细胞特性;免疫细胞化学染色、Western blot和RT-PCR方法检测U87肿瘤细胞及其BTSCs中NANOG的表达。(3)按照RNA干扰序列设计原则结合慢病毒载体质粒pLKO.1-puro结构的特征设计合成shRNA序列,通过分子克隆技术构建NANOG基因RNA干扰慢病毒载体pLKO.1-NANOG-shRNA,连同包装质粒pCMV-dR 8.2 dvpr和包膜质粒pCMV-VSV-G共同转染293T包装细胞,收集储存可表达NANOG特异性shRNA慢病毒载体的病毒颗粒并进行滴度测定。结果(1) NANOG蛋白在胶质瘤组织WHOⅡ级、Ⅲ级和IV级中的差异有统计学意义(F=14.918,P=0.000),NANOG mRNA的相对含量在胶质瘤组织WHOⅡ级、Ⅲ级、IV级中的差异有统计学意义(F=65.901,P=0.000),NANOG蛋白和mRNA表达水平随着病理级别增高而升高,而在正常脑组织中均未见表达。(2)利用无血清悬浮培养法从U87胶质瘤细胞系中成功分离培养出BTSCs,具有自我更新与增殖能力,表达特异性干细胞标记物CD133,在SCM中BTSCs发生贴壁分化,表达神经元和星形胶质细胞的特异性标记物NSE和GFAP。NANOG蛋白水平在U87肿瘤细胞和BTSCs中的差异有统计学意义(t=5.719,P=0.000),NANOG mRNA相对含量在U87肿瘤细胞和BTSCs中的差异有统计学意义(t=4.770,P=0.000),BTSCs的NANOG蛋白和mRNA表达水平高于U87肿瘤细胞。(3)构建的NANOG基因RNA干扰慢病毒载体pLKO.1-NANOG-shRNA经PCR鉴定和测序,结果与设计序列完全相符,慢病毒重组体构建成功,将pLKO.1-NANOG-shRNA、pCMV-dR 8.2 dvpr和pCMV-VSV-G三质粒共同转染293T包装细胞后,收获病毒并测定病毒滴度为10~6TU/ml。结论(1) NANOG在胶质瘤组织中高表达,表达水平随着病理级别增高而升高,而在正常脑组织中均未见表达。(2) U87胶质瘤细胞系中存在具有自我更新及多向分化能力的BTSCs;NANOG在U87胶质瘤细胞系中高表达,在BTSCs中表达水平高于U87肿瘤细胞。(3)成功构建了慢病毒RNAi载体pLKO.1-NANOG-shRNA,测序验证构建成功,并完成了病毒的包装、储存和滴度的测定,为后续进一步体内外研究干扰NANOG基因的表达对胶质瘤细胞生物学活性的影响奠定基础。