血友病是一种X染色体连锁的隐性遗传性疾病,是由编码凝血因子的基因(F8和F9)突变导致的先天性凝血机制障碍的疾病。在血友病患者中大约有80%为重型患者,重型血友病患者的凝血因子的功能活性小于正常值的1%,频繁性的出血不止使得患者常伴有严重的关节病或早期死亡。只要将凝血因子的活性提高到5%就可以使重型血友病患者的症状得到明显改善。由于凝血因子Ⅸ(F9)的活性中心位于最后2个外显子上,无义突变使得翻译提前终止,往往造成了重型血友病患者。根据血友病数据库中登记的点突变类型,发现在F9基因的突变中,无义突变占了11.1%。为了阐明F9基因无义突变导致重型血友病的分子机制、哺乳动物细胞NMD途径和NAS途径机制,为无义突变导致遗传性疾病的治疗提供理论基础,本研究以F9基因为研究对象,对其不同位置发生无义突变后的分子生物学现象进行分析,获得如下结果：1.构建了人凝血因子Ⅸ小基因Mini-hF9,该基因包括3个部分,分别为：外显子1+部分内含子1(673bp)、部分内含子5+外显子6+部分内含子6(2115bp)、部分内含子6+外显子7+内含子7+外显子8(1553bp)。构建了含有Mini-hF9基因的重组表达质粒pCMV-MH-Mini-hF9,并将其转染到细胞中,通过RT-PCR及Western Blot分析发现,小基因可以正确剪接并表达全长蛋白。2.根据血友病数据库中登记的点突变类型,设计并构建了5个无义突变体：El (nt95T>A in Exon1)、E7a (nt34G>T in Exon7)、E7b (nt85G>T in Exon7)、 E7c (nt52G>T in Exon7)和E8(nt42C>T in Exon8)。通过RT-PCR分析发现在无义突变体E7a、E7b、E7c中除了产生正常的剪接体Norm mRNA外,还产生了2个选择性剪接体Alt-S1mRNA和Alt-S2mRNA;通过Western Blot检测发现无义突变E7a、E7c中截短型蛋白(由于无义突变导致蛋白质翻译提前终止而产生截短型蛋白)的表达量较低。3. qRT-PCR分析Mini-hF9基因及其无义突变体中Norm mRNA水平,发现E7a和E7c中Norm mRNA水平明显降低,而El、E7b、E8三个无义突变体中Norm mRNA水平与WT野生型相比没有明显变化,由此推断E7a和E7c中可能发生NMD途径来降解Norm mRNA。通过CHX(放线菌酮)处理实验发现,在使用CHX处理细胞(CHX作为一种蛋白质合成抑制剂,能够通过抑制蛋白质翻译进而抑制NMD途径)后,无义突变体E7a和E7c中Norm mRNA水平明显升高。此外,构建了干扰NMD途径关键因子UPF1、SMG1的干扰质粒pSIR-hUPF1、 pSIR-hSMGl及对照质粒pSIR-Control,建立了稳定的RNAi干扰体系。通过RNAi干扰实验发现,干扰细胞内源UPF1或SMG1后,无义突变体E7a和E7c中Norm mRNA水平明显升高,结合CHX实验的结果充分证明了无义突变体E7a和E7c中确实发生NMD途径降解Norm mRNA。4.通过argetScan预测到SMG1mRNA的3’-UTR上可能存在miR-125a和miR-125b的结合靶位点(即MRE)。PCR扩增SMG13’-UTR序列并克隆到检测miRNA作用的双荧光素酶报告质粒pmirGLO上得到报告质粒pmirGLO-SMG1-WT,并构建突变质粒pmirGLO-SMGl-MU (miR-125靶位点突变),通过双荧光素酶报告系统检测发现,过表达miR-125a或miR-125b均能够降低WT报告质粒中萤火虫荧光素酶活性,抑制细胞内源miR-125a或miR-125b均能够升高WT报告质粒中萤火虫荧光素酶活性,从而证实TargetScan预测到的miR-125作用的靶位点是特异的、有效的。5.通过Western Blot分析发现,过表达miR-125a或miR-125b均能够降低细胞内源SMG1的表达,证明miR-125能够调节SMG1蛋白的表达。此外,通过qRT-PCR分析发现,过表达miR-125a或miR-125b均能够降低细胞内源SMG1的mRNA水平,抑制细胞内源miR-125a或miR-125b均能够提高SMG1的mRNA水平,从而证实miR-125能够通过促进SMG1mRNA的降解进而降低细胞内源SMG1蛋白的表达。6.通过qRT-PCR分析发现,过表达miR-125a或miR-125b均能够提高NMD靶标mRNA的水平,抑制细胞内源miR-125a或miR-125b均能够降低NMD靶标mRNA的水平,证实miR-125作为一个NMD抑制因子,能够通过降低NMD途径关键蛋白SMG1的表达,进而抑制NMD途径。7.通过ESE Finder2.0对Exon7上的ESE序列进行预测发现,只有E7a突变体可能破坏了ESE序列,而E7b和E7c并未破坏ESE序列。构建E7aE (nt34G>A in Exon7)、E7bE (nt85G>A in Exon7)、E7cE (nt52G>C in Exon7)三个错义突变体,通过RT-PCR分析发现这三个错义突变体并没有发生明显的选择性剪接,从而证明E7a、E7b、E7c中的选择性剪接体Alt-S1和Alt-A2是由于NAS途径导致。8.UPF2作为NMD的关键蛋白之一,但其并不参与到NMD途径中,RNAi干扰UPF2后,通过qRT-PCR检测发现,E7a、E7b、E7c突变体中Alt-S1剪接体水平无明显变化,而E7a、E7c中Norm剪接体水平明显升高,E7b中Norm剪接体水平无明显变化,再次证明了E7a和E7c中发生了NMD途径,E7a、E7b、E7c中发生NAS途径。此外RNAi干扰SMG6后,通过qRT-PCR分析发现,E7a、E7b突变体中Alt-S1剪接体水平明显下降,由此推测SMG6可能是NAS途径中的一个关键蛋白。9.通过qRT-PCR对Mini-hF9(WT野生型)及其无义突变体E7a、E7b、E7c中的三种剪接体进行定量分析发现,WT野生型中Norm、Alt-S1、Alt-S2三种剪接体的含量分别为98.5%、1.1%、0.3%; E7a中Norm、Alt-S1、Alt-S2三种剪接体的含量分别为73.7%、25.0%、1.4%；E7b中Norm、Alt-S1、Alt-S2三种剪接体的含量分别为92.2%、7.0%、0.8%；E7c中Norm、Alt-S1、Alt-S2三种剪接体的含量分别为68.1%、30.9%、1.1%。10.成功构建了含人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体E7a, E7c的稳定细胞株HeLa-WT、HeLa-E7a、HeLa-E7c,并通过RT-PCR及Western Blot分析证实构建成功。使用不同浓度的促通读药物PTC124、G418处理稳定细胞株后,通过qRT-PCR分析发现,无义突变体细胞株HeLa-E7a中NMD靶mRNA (Norm剪接体)的水平无明显变化,说明促通读药物PTC124、G418并没有抑制NMD途径的发生。