论文部分内容阅读
Serpin和PPO参与调节生物体内众多生理反应。为研究野桑蚕和家蚕serpins的表达及PPO的活性，本文在以下方面做了研究：克隆了野桑蚕serpin-1、serpin-2、serpin-3、serpin-4、serpin-5和serpin-6这6个基因，并经测序后分析其基因序列；分析比较家蚕和野桑蚕不同发育时期、不同组织中serpins的转录水平；分析比较家蚕和野桑蚕不同发育时期、不同组织中的PPO活性。结果如下： 1.野桑蚕serpins基因的克隆和分析 以野桑蚕幼虫全组织cDNA为模板，经克隆、测序成功获得了野桑蚕serpins基因的开放阅读框（ORF）序列，GenBank登录号分别为：KR003729，KR003725，KR003726，KR003727，KR003728，KR003730。野桑蚕serpins基因的ORF序列长1137～1371bp，编码378～458个氨基酸，蛋白分子量42～51kDa，等电点在4.65～7.32之间。 经与家蚕serpins比对发现，野桑蚕与家蚕serpins核苷酸序列的同源性很高，其中serpin-3的同源性最高，为99.27％；最低的serpin-6其同源性也达到了97.83％。基因结构分析显示，家蚕和野桑蚕在相同位置均有一个典型的SERPIN结构域，其中的活性中心环（reactive centre loop,RCL）位于C末端，其序列具有很高的保守性，另外断裂位点（the reactive center site,P1）位点相同。聚类分析显示，野桑蚕与家蚕serpins的关系最近，表明serpin在进化过程中保守性较好。 2.家蚕和野桑蚕serpins基因转录特异性分析 采用荧光定量PCR研究了家蚕（4龄末至游走期）、野桑蚕（5龄期间）脂肪体和体壁的转录特征。结果表明：家蚕脂肪体serpin-1、2、4、5、6的转录水平以五龄中期及游走期较高，serpin-3则是在初期较高。家蚕体壁serpin-1、2、4、5的转录水平以五龄中后期较高，serpin-3和serpin-6则是在游走期较高。野桑蚕脂肪体和体壁serpins的转录水平均是五龄初期高于中期和后期。 比较五龄期间家蚕、野桑蚕serpins的表达水平，野桑蚕脂肪体serpins的转录水平均低于家蚕脂肪体serpins；野桑蚕体壁serpins的转录水平在五龄初期高于家蚕；而在五龄中后期，野桑蚕体壁serpins的转录水平均低于家蚕。以上结果表明家蚕和野桑蚕serpins的转录水平时间、空间特异性并不相同。 3.家蚕和野桑蚕PPO活性差异比较 选取菁松、黒缟、大造和野桑蚕，测定其在不同发育时期、不同组织中PPO的活性。结果表明：菁松血淋巴PPO活性是五龄中期高于其他发育阶段；体壁PPO活性也是五龄中期高于其他发育阶段。黒缟血淋巴PPO活性是五龄初期高于其他发育阶段；体壁PPO活性则是五龄中期高于其他发育阶段。大造血淋巴PPO活性是五龄初期高于其他发育阶段；体壁PPO活性则是五龄中期高于其他发育阶段。野桑蚕血淋巴PPO活性是五龄中期高于其他发育阶段；体壁PPO活性则是五龄末期高于其他发育阶段。 血淋巴PPO活性高低依次为菁松、黒缟、大造、野桑蚕，体壁中PPO活性高低依次为大造、黒缟、菁松、野桑蚕。不论是血淋巴还是体壁，野桑蚕PPO活性均低于家蚕。家蚕中，菁松血淋巴PPO活性高，而体壁PPO活性较低；与之相反，大造血淋巴PPO活性低，而体壁PPO活性高；黒缟这一现象不显著。以上结果表明野桑蚕血淋巴和体壁中的先天免疫均低于家蚕。 本研究克隆野桑蚕serpins基因并分析其序列，比较了家蚕和野桑蚕serpins基因的时间和组织特异性，这些研究工作为家蚕、野桑蚕serpin的研究提供了理论基础。本文同时还比较了家蚕和野桑蚕不同组织中PPO的活性，其结果对理清家蚕起源中的一些关键问题具有一定的参考意义。