本实验针对哮喘患者体内T-bet基因表达低下之现实,拟通过靶向基因转染方式增加气道T-bet基因表达,探讨T-bet基因在哮喘治疗中的作用.第一章哮喘患儿转录因子 T-bet/GATA-3 mRNA表达及其与Th1/Th2平衡间的关系以前的研究多以检测细胞因子水平来间接代表Th1、Th2细胞功能状态,直接从数量上检测哮喘患者Th1、Th2细胞分化状态的报道甚少,对影响哮喘患者Th1、Th2细胞分化的上游过程,特别是Th2优势分化的"始动"机制更是了解甚少.研究转录因子T-bet/GATA-3在小儿哮喘发病以及Th1/Th2失衡中的作用,国内外只有极少文献报道.本实验拟通过半定量RT-PCR检测部分哮喘患儿外周血单个核细胞(PBMC)中T-bet、GATA-3mRNA表达情况,同时采用三色荧光流式细胞仪检测哮喘患儿的Th1、Th2细胞数量,了解T-bet/GATA-3对哮喘患儿的Th细胞分化的调节作用,为进一步的T-bet基因治疗提供依据 第二章小鼠T-bet基因表达载体的构建与鉴定T-bet(T-box expressed in T cells)基因是2000年发现的一个新基因,其表达低下与哮喘发病直接相关,成为哮喘治疗的新基因靶点.构建合适表达载体是研究T-bet基因在哮喘治疗中作用的前提.目前基因治疗常用的体内表达载体有真核表达质粒、腺病毒和逆转录病毒及腺相关病毒等载体.真核表达质粒转染效率相对较低,但操作方便简单,且安全性好,长期使用无明显副反应;病毒载体具有转染效率较高的优点,但长期使用会产生抗原性等缺点.本实验依次构建小鼠T-bet基因真核表达载体pcDNA3-T-bet、pCI-T-bet-GFP,逆转录病毒载体PMSCV-T-bet和腺病毒载体pAdeno-T-bet.第三章脂质体介导的T-bet基因气道转导对哮喘小鼠气道炎症及Th1/Th2平衡的影响现在基因治疗已扩展到凡是在基因水平上进行操作而达到治疗疾病的所有疗法,目前国外已采用基因疗法来治疗支气管哮喘.使用DNA重组技术设法修复或调节细胞中有缺陷基因,使细胞恢复正常功能,可以减少支气管平滑肌痉挛,减少变态反应,从而缓解支气管哮喘.近年来随着人们对哮喘发病机制的深入认识和基因转移技术的迅速发展,国内外学者对哮喘基因治疗作了众多有益的探索,均显示出对哮喘小鼠气道炎症或气道高反应性的一定抑制作用.然而这些方法要么转入单一Th1类细胞因子基因,要么封闭单一Th2因子基因,疗效仍不理想.我们在成功构建小鼠T-bet真核表达质粒的基础上,拟进一步研究气道内T-bet质粒转导能否逆转Th1/Th2失衡以及对哮喘小鼠气道炎症的影响,为哮喘的临床基因治疗作有益探索.