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[目 的]探讨紫杉醇联用槲皮素对前列腺癌PC-3细胞增殖的影响,以及槲皮素逆转PC-3细胞对紫杉醇耐药的机制,为前列腺癌新的化疗方案研究提供基础。[方 法](1)采用CCK-8法检测,计算槲皮素和紫杉醇对前列腺癌PC-3细胞的IC50。计算紫杉醇联合1/1 0槲皮素IC50时PC-3细胞对紫杉醇的IC50。(2)根据两种药物IC50结果,用不同浓度槲皮素联合同浓度紫杉醇处理PC-3细胞,以单用紫杉醇作为组内对照。实验分组:空白对照组K,紫杉醇组A(IC50紫杉醇),紫杉醇定量检测组B、C、D、E(B:2/3IC50槲皮素+IC50紫杉醇、C:IC50槲皮素+IC50紫杉醇、D:4/3IC50槲皮素+IC50紫杉醇、E:5/3 IC50槲皮素+IC50紫杉醇)。CCK-8法检测各组细胞活力,Annexin V/PI双染检测各组细胞凋亡水平。倒置显微镜下观察各组细胞变化。以槲皮素IC50浓度联合不同浓度紫杉醇处理PC-3细胞,以单用槲皮素作为组内对照。实验分组:空白对照组k,槲皮素组(IC50)a,槲皮素定量检测组b、c、d、e(b:IC50槲皮素+1/2 IC50紫杉醇、c:IC50槲皮素+IC50紫杉醇、d:IC50槲皮素+2倍IC50紫杉醇、e:IC50槲皮素+4倍IC50紫杉醇),检测细胞活力和凋亡水平,倒置显微镜下观察细胞变化。选取对PC-3细胞抑制率和凋亡率相近的组进行紫杉醇剂量比较。(3)采用药物剂量浓度递增的方法,建立紫杉醇耐药株PC-3DR。采用CCK-8法检测,计算 X 组:单用槲皮素(0、25、50、100、200、400、800μM)对 PC-3DR细胞的 IC50。Y 组:单用紫杉醇(0、25、50、100、200、400nM)对 PC-3DR细胞的IC50。Z组:紫杉醇联合1/10槲皮素IC50对PC-3DR细胞的IC50。计算耐药逆转指数。(4)实时荧光定量PCR检测J组:PC-3DR细胞;和Q组:经1/10槲皮素IC50处理过的PC-3DR细胞的多药耐药相关蛋白基因1,蛋白印迹法检测P糖蛋白,葡萄糖调节蛋白78、β3-微管蛋白蛋白水平的变化。(5)数值资料用平均数±标准差描述,两组独立样本用Wilcoxon秩和检验,各组间两两比较采用Kruskal-Wallis H检验。按照α=0.05的检验标准,以*P<0.05差异有统计学意义。[结 果](1)IC50检测结果:槲皮素 IC50=180.21 ±0.27μM,紫杉醇 IC50=19.88±0.52nM。紫杉醇联合小剂量槲皮素(1/10槲皮素IC50)后,PC-3细胞对紫杉醇的IC50=14.48± 1.32nM,与单独使用紫杉醇相比,IC50下降,P<0.05,达到相同抑制率时使用紫杉醇的药物浓度可以明显减少,提示槲皮素能增加PC-3细胞对紫杉醇的敏感性。(2)A、B、C、D、E 各组细胞活力为:50.87±1.06%,47.86±0.20%,33.61±0.93%,25.31±1.32%,14.72±2.03%。细胞凋亡率为:50.14±2.21%,62.28±3.03%,68.97±6.27%,75.87±3.60%,85.13±4.19%。细胞活力及凋亡率与槲皮素呈浓度依赖性。倒置显微镜下可见经紫杉醇联合槲皮素作用后的细胞形态无明显变化,细胞密度剂量依赖,即槲皮素浓度越高,作用越明显。a、b、c、d、e 各组细胞活力为:50.98±4.19%,47.09±4.19%,34.91 ±4.91%,21.32±1.28%,14.72±2.24%。细胞凋亡率为:50.80±3.96%,55.94±4.30%,67.31±3.99%,74.97±3.56%,86.48±2.27%。细胞活力及凋亡率与紫杉醇素呈浓度依赖性,倒置显微镜下可见经槲皮素联合紫杉醇作用后的细胞形态无明显变化,细胞密度呈剂量依赖,即紫杉醇浓度越高,作用越明显。B组与b组,D组与d组,E组与e组进行比较,PC-3细胞抑制率和凋亡率无明显差异(P>0.5),b组比B组紫杉醇浓度低,D组比d组紫杉醇浓度低,E组比e组紫杉醇浓度低。提示达到相同抑制和凋亡效果,槲皮素可以减少紫杉醇的使用量。(3)X 组 IC50=211.56±2.39μM,Y 组 IC50=139.17±2.45nM,Z 组 IC50=114.74±1.93nM。与Y组相比,Z组的RF=1.30。槲皮素能增加PC-3DR细胞对紫杉醇的敏感性;并且当两者联用时,PC-3DR细胞对紫杉醇的IC50下降。(4)实时荧光定量PCR检测结果显示:J组和Q组MRP1 mRNA分别为6.16±0.38 和 4.13±0.11,与亲本 PC-3 细胞相比(1.06±0.08),P<0.01,提示PC-3DR细胞MDR形成与MRPI mRNA升高有关。与J组相比Q组MRP1 mRNA降低(P<0.05),提示槲皮素逆转PC-3DR细胞对紫杉醇耐药性可能与降低MRP1 mRNA有关。WB检测结果显示:J组和Q组G-pg分别为1.24±0.07和1.17±0.03,与亲本PC-3细胞(0.98±0.11)相比,P>0.05,提示PC-3DR细胞的MDR与G-pg表达没有明显关系。J组GRP78为16.13±0.33,与PC-3细胞(6.83±0.08)相比,P<0.01,提示PC-3DR细胞的MDR可能与GRP78表达有关;Q组GRP78为20.52±0.83,与PC-3细胞相比,P<0.01,与J组相比,P<0.05,提示槲皮素增加紫杉醇敏感性可能与GRP78表达有关。J组的β3-微管蛋白为13.40±0.43,与PC-3细胞(5.68±0.39)相比,P<0.01,提示PC-3DR细胞的MDR与β3-微管蛋白表达有关;Q组β3-微管蛋白为7.50±1.00,与PC-3细胞相比,P<0.05,但与J组比较,P<0.01,提示槲皮素逆转PC-3DR细胞对紫杉醇耐药性可能与降低β3-微管蛋白的表达有关。[结论](1)槲皮素能够增加PC-3细胞对紫杉醇的敏感性;(2)槲皮素逆转PC-3细胞对紫杉醇的耐药性可能与调节MRP1 mRNA,β3-微管蛋白和GRP78的表达有关。