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目的：将同源重组技术与Cre-lOxP位点特异性重组系统结合起来,在变链菌中构建htrA基因缺陷株和clpP基因缺陷株,并分别删除其抗生素抗性标记,获得无标记的单基因突变株,为构建无标记的基因缺陷株奠定基础。利用以Cre-loxP系统为基础的Cre-loxP*系统构建变链菌htrA和clpP双基因缺陷株,并删除抗生素抗性标记,获得无标记的双基因突变株,为构建无标记的多基因缺陷株提供一种新的方法。这三种缺陷株也将为进一步研究htrA基因和clpP基因在变链菌致龋过程中的作用提供实验菌株。方法：1.设计引物PCR扩增卡那霉素(Km)抗性基因,使loxP位点位于Km抗性基因的两侧,构建出Km抗性基因盒(loxP-Km-lOxP).PCR扩增变链菌的htrA基因片段并克隆到pGEM-T-Easy TA载体后,双酶切以去除htrA基因的部分序列,并连入lOxP-Km-loxP,构建出htrA基因缺陷的同源重组载体pIB△htrA-Km。将该质粒线性化并电转化变链菌标准株,Km抗性筛选出发生同源重组的菌株,即htrA基因缺陷株。2.设计引物PCR扩增大观霉素(Sp)抗性基因,使loxP位点位于Sp抗性基因的两侧,构建出Sp抗性基因盒(loP-Sp-loxP)。PCR扩增变链菌的clpP基因片段并克隆到pGEM-T-Easy TA载体后,双酶切以去除clpP基因的部分序列,并连入lOxP-Sp-loxP,得到clpP基因缺陷的同源重组载体pIB△clpP-Sp。将该质粒线性化并电转化变链菌标准株,Sp抗性筛选出发生同源重组的菌株,即clpP基因缺陷株。3.以热敏质粒pCrePA分别电转化htrA基因缺陷株和clpP基因缺陷株,分别删除Km抗性标记和Sp抗性标记,改变温度培养以消除质粒pCrePA,分别获得无标记的htrA.clpP单基因缺陷株,并经PCR及DNA测序鉴定。4.按照上述方法构建出lOx71-Km-lox66和lox71-Sp-lox66,分别替换loxP-Km-loxP和loxP-Sp-loxP。利用上述方法构建无标记的htrA基因缺陷株,继而在该缺陷株中删除clpP基因及Sp抗性标记,获得无标记的htrA和clpP双基因缺陷株,并进行PCR分析及DNA测序鉴定。结果：1.PCR扩增得到的Km抗性基因、Sp抗性基因、htrA基因、clpP基因片段经琼脂糖凝胶电泳检测,可见扩增产物为清晰的单一条带,未见非特异性扩增,分子量大小与预期大小一致。2.经酶切鉴定目的质粒各片段插入无误,含有目的质粒的大肠杆菌可分别在Km抗性、Sp抗性的LB培养基中生长良好,Km抗性的htrA基因缺陷株可在含Km的TSA和TPY培养基中生长良好,Sp抗性的clpP基因缺陷株可在含Sp的TSA和TPY培养基中生长良好,这都说明Km抗性和Sp抗性基因都正确表达。3.对无标记基因缺陷株的目的区域进行PCR扩增及DNA测序鉴定,结果显示htrA和clpP基因的部分序列已被删除,且无抗性标记。在单基因缺陷株中目的区域只保留一个34bp的loxP位点,在多基因缺陷株中目的区域只保留一个34bp的lox72位点。结论：本研究利用Cre-loxP位点特异性重组系统和同源重组技术成功构建出变链菌的无标记的单基因缺陷株(htrA基因缺陷株、clpP基因缺陷株)以及htrA和clpP双基因缺陷株,为构建无标记的多基因缺陷株提供了一种新的有效的方法,并为进一步研究htrA和clpP基因的功能提供了实验菌株。