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实验目的:转移是引起肝癌患者死亡最主要的原因之一,因此探讨肝癌发生转移的分子机制对于降低肝癌死亡率具有重要的意义。Dickkopf-1(DKK1)是Dickkopf基因家族的成员之一,在肝癌组织中表达异常升高,且DKK1与肝癌的转移以及不良预后呈正相关。然而,肝癌细胞如何调控DKK1的转录合成目前尚无文献报道。本课题通过诠释DKK1在肝细胞癌中发生上调的转录调控机制及其在肝细胞癌转移中的作用,有助于阐明肝癌转移的分子机制,为肝癌的防治提供可能的新策略和新靶点。实验方法:1、探讨DKK1在肝癌中的表达及功能:采用Real-time PCR、Western blot、免疫组织化学染色实验检测二乙基亚硝胺(Diethyl nitrosamine,DEN)诱导的肝癌大鼠模型中DKK1表达的变化;ELISA实验检测肝癌大鼠模型血清中DKK1含量的变化;免疫组织化学染色实验检测肝癌临床标本及其癌旁组织中DKK1表达的变化;采用皮下移植瘤模型和肺转移模型检测DKK1对肝癌生长和转移的影响。2、探讨表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)介导DKK1转录调控:给予表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)孵育四种肝癌细胞系(Hep G2、Huh-7、SNU-368、SNU-739),采用Real-time PCR、Western blot实验检测DKK1表达的变化;ELISA实验检测细胞培养基中DKK1含量的变化;给予EGF孵育肝癌细胞的同时,敲减EGFR表达或给予EGFR抑制剂Gefitinib,采用Real-time PCR、Western blot实验检测DKK1表达的变化;给予EGF的同时,分别给予JAK/STAT3通路抑制剂AG490、MEK/ERK通路抑制剂PD98059、PI3K/AKT通路抑制剂LY294002共同孵育肝癌细胞后,采用Real-time PCR、Western blot实验检测DKK1表达的变化。3、探讨AKT介导的p300 Ser1834位点的磷酸化参与了肝细胞癌中EGFR对DKK1的转录调控:给与EGF孵育肝癌细胞,Western blot实验检测p300 Ser1834位点的磷酸化情况;给予AKT抑制剂MK2206与EGF共同孵育肝癌细胞,采用Western blot实验检测p300 Ser1834位点的磷酸化情况;给予EGF孵育肝癌细胞同时,敲减p300的表达,采用Real-time PCR、Western blot实验检测DKK1表达的变化;构建p300 WT质粒、p300 S1834A质粒(磷酸化缺失)、p300 S18347D质粒(模拟磷酸化),将其转染至肝癌细胞中,采用Real-time PCR、Western blot实验检测DKK1表达的变化。4、探讨p300对组蛋白H3K9位点的乙酰化参与肝细胞癌中EGFR对DKK1的转录调控:给予EGF孵育肝癌细胞,采用Western blot实验检测H3K9位点的乙酰化情况;CO-IP实验检测H3与p300位点的相互作用;采用Western blot实验检测敲低p300后H3K9位点的乙酰化情况;将p300 WT质粒、p300 S1834A质粒、p300 S18347D质粒,分别转染至肝癌细胞中,采用Western blot实验检测H3K9位点的乙酰化情况;用EGF孵育肝癌细胞,将RNAi-resistant Histone H3 WT质粒和RNAi-resistant Histone H3-K9R质粒转染至敲减Histone H3后的肝癌细胞中,采用Real-time PCR、Western blot实验检测DKK1的表达情况;染色质免疫共沉淀实验检测Acetyl-H3K9与DKK1启动子区域结合情况;采用免疫组织化学实验和Western blot实验检测大鼠肝癌模型Acetyl-H3K9的表达;免疫组织化学染色实验实验检测肝癌临床标本Acetyl-H3K9的表达,然后将其与DKK1的表达作相关性分析。实验结果:1、在DEN诱导的肝癌大鼠模型中,肝癌组织中DKK1 mRNA和蛋白的表达显著上调,并且其在肝癌大鼠血清中的含量也显著上调;在临床标本中,DKK1在肝癌组织中的表达也显著高于癌旁组织;皮下移植瘤模型和肺转移模型结果显示,过表达DKK1可促进肿瘤的生长和转移,而基因敲减DKK1则抑制肿瘤生长和转移。2、给予EGF孵育Hep G2、Huh-7、SNU-368、SNU-739等四种肝癌细胞,DKK1 mRNA和蛋白的表达显著上调,并且其分泌到细胞培养基中的量也相应增多;基因敲减EGFR可显著逆转EGF介导的DKK1 mRNA和蛋白的表达,Gefitinib同样可逆转EGF介导的DKK1 mRNA和蛋白的表达;PD98059和LY294002可显著逆转EGF引起的DKK1mRNA和蛋白表达的上调,而AG490则对EGF介导的DKK1 mRNA和蛋白的表达无影响。3、给予EGF孵育肝癌细胞Hep G2和Huh-7,可显著上调p300 Ser1834位点磷酸化水平;基因敲减p300可显著逆转EGF诱导的DKK1 mRNA和蛋白水平的上调;将p300 S18347D质粒转染至Hep G2和Huh-7中,可显著上调DKK1 mRNA和蛋白表达的变化,而p300 WT质粒和p300 S1834A质粒则无此作用。4、给予EGF孵育肝癌细胞Hep G2和Huh-7可显著上调组蛋白H3K9位点的乙酰化水平,并且p300和H3相互作用也会增强;基因敲减p300的表达则会逆转EGF引起的H3K9位点的乙酰化;将p300 S18347D质粒转染至Hep G2和Huh-7中,可显著促进H3K9位点的乙酰化,而p300 WT质粒和p300 S1834A质粒则无此作用;基因敲减H3时过表达RNAi-resistant Histone H3-K9R质粒可显著下调DKK1 mRNA和蛋白的表达;在DEN大鼠模型中,Acetyl-H3K9的表达水平显著上调,且Ch IP实验显示Acetyl-H3K9与DKK1启动子区域募集增强;在肝癌临床标本中Acetyl-H3K9与DKK1的表达具有正相关性。实验结论:EGF/EGFR通过PI3K/AKT信号通路磷酸化p300 Ser1834位点,进而介导组蛋白H3K9位点的乙酰化,促进DKK1的转录,从而诱导肝癌转移。