结直肠癌是临床上常见的消化道恶性肿瘤之一,近年来其发病率有明显上升的趋势,并且治愈率低,严重威胁人类健康。肿瘤预防与治疗的进步离不开新的化学治疗药物的开发,最近发现最有希望应用于肿瘤治疗的的天然化合物是三萜类化合物,其中白桦酸是最典型的代表。已有研究显示,白桦酸在肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤中具有抗肿瘤效应,但其在结直肠癌中的治疗作用尚未见报道。此外,细胞自噬属于II型程序性细胞死亡,其相关机制研究已成为肿瘤治疗研究的一个新热点。本论文对白桦酸抗结直肠癌的效应以及自噬在该效应中的作用及机制进行了初步系统研究。(1)白桦酸通过促调亡作用抑制结直肠癌细胞增殖使用对照和不同浓度的白桦酸,分别处理结直肠癌细胞系HCT116、SW480和HT29 48h。细胞增殖分析显示,白桦酸显著抑制上述结直肠癌细胞的增殖,并且抑制程度具有浓度依赖性。进而,采用Annexin-V/PI双染法流式凋亡检测、DAPI细胞核染色和Western Blot对细胞凋亡进行分析。流式结果显示,在以上三种结直肠癌细胞中,与对照组相比,白桦酸处理组细胞凋亡比率显著增多,并且凋亡率具有浓度依赖性;DAPI染核结果显示,随着白桦酸处理浓度的增大,细胞核固缩程度依次递增,并且出现核固缩的细胞数量依次递增;Western blot结果显示,与对照组相比,白桦酸处理组促凋亡因子caspase3激活和parp蛋白剪切增加。上述结果提示,白桦酸可通过诱导细胞凋亡而抑制结直肠癌细胞增殖。(2)白桦酸促进结直肠癌细胞自噬的发生和自噬流的形成透射电镜观察结果显示,在hct116细胞中,与对照组相比,白桦酸处理组细胞内自噬泡的数量和含有5个以上自噬泡的细胞数量均显著增多。吖啶橙染色结果显示,随着白桦酸处理浓度的增加,三种结直肠癌细胞系中酸性自噬泡的数量均显著增加。同时,激光共聚焦或者荧光显微镜观察显示,随着白桦酸处理浓度的增加,上述细胞中lc3斑点逐渐增多,并且含有lc3斑点的细胞数量也逐渐增多。间接免疫荧光结果显示,与对照组相比,白桦酸处理组细胞内lc3斑点数量显著增多。westernblot结果显示,lc3-i转化为lc3-ii。rt-pcr结果显示,白桦酸显著诱导了atg5等自噬关键基因的表达。上述结果表明,白桦酸能显著促进结直肠癌细胞自噬发生。此外,免疫共定位分析显示,白桦酸可以促进自噬溶酶体的增多。westernblot结果显示,氯喹或蛋白酶抑制剂处理可进一步促进白桦酸诱发的lc3-ii积累。这些结果表明,白桦酸可以促进结直肠癌细胞自噬流的形成。(3)白桦酸通过抑制akt-mtor信号通路促进自噬发生Akt-mtor是调节自噬的经典信号通路,可抑制自噬发生。westernblot结果显示,与对照组相比,在结直肠癌细胞中,白桦酸处理组细胞的磷酸化mtor和磷酸化akt蛋白表达均显著降低,提示白桦酸通过抑制结直肠癌细胞Akt-mTOR信号通路而激活自噬。(4)抑制自噬可增强白桦酸对结直肠癌细胞的增殖抑制效应细胞增殖分析结果显示,采用自噬抑制剂氯喹处理或者si RNA介导的自噬关键基因ATG5基因沉默策略分别抑制自噬,均能显著增强白桦酸对结直肠癌细胞的增殖抑制率。同时,Annexin-V/PI双染法流式检测凋亡结果显示,抑制自噬也进一步显著促进了白桦酸诱导的结直肠癌细胞凋亡;Western Blot结果显示,抑制自噬还显著促进了促凋亡蛋白PARP的剪切激活以及抗凋亡因子bcl-xl的下调,反向提示自噬可以抑制白桦酸对结直肠癌细胞的促凋亡和增殖抑制效应。综上,本研究的结果表明,白桦酸可通过诱导细胞凋亡而抑制结直肠癌细胞增殖,白桦酸还可通过抑制Akt-mTOR信号通路而激活结直肠癌细胞自噬,而抑制自噬则可增强白桦酸在结肠癌细胞中的抗肿瘤效应。本研究初步系统阐释了白桦酸的抗结直肠癌效应与机制,为进一步的机制研究以及未来将白桦酸开发为新型的抗肿瘤药物奠定了坚实基础,具有积极的理论和现实意义。