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质膜H+-ATPase是植物细胞膜上含量最丰富的蛋白,它是调节气孔开度的主要酶之一,参与植物应答多种生物和非生物胁迫。14-3-3蛋白通过与磷酸化质膜H+-ATPase的相互作用而调控其活性。质膜H+-ATP酶的磷酸化水平受多种环境因素的影响,在干旱胁迫下植物的保卫细胞通过ABA的信号传导增加活性氧(H202)的积累,H202能够抑制蚕豆保卫细胞质膜H+-ATPase的磷酸化及与14-3-3蛋白的结合从而抑制质膜H+-ATPase的活性,减少H+的泵出,促进气孔关闭,减少植物的蒸腾速率和失水率。烟草是植物学领域研究广泛应用的模式植物之一。为了利用转基因烟草验证铝胁迫诱导耐铝型黑大豆(RB)14-3-3蛋白和质膜H+-ATPase的表达与互作在调控植物耐铝能力中的作用,本实验室郭传龙的硕士论文在野生型烟草中分别过量表达RB的14-3-3a(SGF14a)和没有C末端自抑制域的质膜H+-ATP酶(ΔGHA2)、同时利用RNAi干扰技术抑制烟草14-3-3和质膜H+-ATPase基因的表达产生四种转基因烟草。本研究用PEG6000模拟干旱胁迫处理野生型(WT)烟草和四种14-3-3蛋白及质膜H+-ATPase表达水平改变的转基因烟草,研究烟草叶片中14-3-3蛋白和质膜H+-ATPase应答干旱胁迫的分子机理,主要取得如下研究结果：水培条件下分别用2%、5%、10%的PEG处理WT烟草0、2、5、12h,结果说明随PEG处理浓度的升高和处理时间的增加,WT烟草的蒸腾速率和气孔传导率逐渐降低,植株失水率逐渐升高。叶片中H202、可溶性糖和脯氨酸的含量也随PEG处理浓度的增加而升高。可溶性蛋白的含量随处理浓度的增加呈先上升后下降的趋势,在2%PEG处理时达到最高。抗氧化酶SOD.POD活性随处理浓度的增加而升高,而CAT活性在2%PEG处理时达到最高,在5%、10%PEG处理时呈下降趋势。H202荧光探针分析证实2%PEG胁迫导致烟草保卫细胞中积累H202的叶绿体数量显著增加。表达谱分析结果表明2%PEG处理诱导WT烟草叶片中大部分(7种)14-3-3基因和2种质膜H+-ATPase(pma2、pma3)基因的表达。随处理时间的增加抗氧化酶APX.CAT的表达上调,POD的表达下调。免疫共沉淀分析结果表明叶片质膜H+-ATPase的磷酸化水平及其与14-3-3蛋白的相互作用随2%PEG处理时间的增加而降低,质膜H+-ATPase活性、氢泵活性以及气孔开度也呈下降趋势。这些结果说明WT烟草是一种对PEG干旱胁迫非常敏感的植物,通过增加叶片H202的积累降低质膜H+-ATPase的磷酸化水平及其与14-3-3蛋白的相互作用来减少质膜H+-ATPase的活性和气孔传导率及蒸腾失水是烟草适应干旱胁迫的一个重要机制。在荧光显微镜下观察过量表达SGF14a和GFP融合蛋白转基因烟草叶片的下表皮,证实有部分SGF14a表达后被定位在保卫细胞膜上。通过免疫共沉淀分析选取与磷酸化质膜H+-ATPase互作水平最高的SGF14a过表达株系S23作为PEG处理的实验材料。表达谱分析结果显示在没有PEG和有2%PEG干旱胁迫12h,S23中的Ntl4-3-3及APX、CAT基因的转录水平均高于WT烟草,可能是由于SGF14a的过量表达上调了Nt14-3-3基因的表达所致。在没有和有PEG干旱胁迫时S23叶片的APX、CAT、POD活性都高于WT,从而使S23叶片中H202含量低于WT,H2O2荧光探针分析表明S23保卫细胞中积累H202的叶绿体数低于WT。在2%PEG干旱胁迫下S23气孔开度、失水率、光合速率、气孔传导率、蒸腾速率、质膜H+-ATPase活性和氢泵活性均大于WT。这些结果说明过量表达SGF14a使转基因烟草叶片中抗氧化酶表达水平升高,PEG干旱胁迫12h,保卫细胞中H2O2的产生减少,质膜H+-ATPase的活性和氢泵活性升高,气孔开度、失水率、光合速率、气孔传导率、蒸腾速率增加,转基因烟草耐旱能力降低。通过免疫共沉淀分析选取与磷酸化质膜H+-ATPase互作水平最低的14-3-3抑制表达株系RE10作为PEG处理的实验材料。表达谱分析结果显示RE10中9个Ntl4-3-3及APX、CAT、POD基因的转录水平均低于WT烟草,说明14-3-3的表达被抑制从而也下调了抗氧化酶基因的表达。在2%的PEG干旱胁迫12h,RE10叶片中APX、CAT、POD活性均低于WT, H2O2含量则高于WT, H2O2荧光探针分析证实RE10保卫细胞中积累H202的叶绿体数显著高于WT,因此其气孔开度小于WT。干旱胁迫下RE10植株失水率、光合速率、气孔传导率、蒸腾速率均低于WT,这是由于RE10叶片质膜H+-ATPase活性和氢泵活性明显低于WT所致。这些结果说明在转基因烟草中抑制Nt14-3-3的表达导致转基因烟草叶片中抗氧化酶表达水平降低,PEG干旱胁迫12h,叶片中H202积累增加,质膜H+-ATPase的磷酸化水平及其与14-3-3蛋白的互作减小,质膜H+-ATPase活性降低,最终使转基因烟草气孔开度减小,蒸腾失水减小,耐旱性增强。通过活性分析选取质膜H+-ATPase活性和氢泵活性最高的AGHA2过量表达株系G-5为PEG处理实验材料。研究结果表明在PEG干旱胁迫12h,G-5叶片的质膜H+-ATPase和氢泵活性均高于WT; H2O2荧光探针分析显示保卫细胞中积累H202的叶绿体数也低于WT,其气孔开度是WT的1.5倍。干旱胁迫下G-5的失水率、光合作用、气孔传导率、蒸腾速率均显著高于WT。这些结果说明在烟草中过量表达有组成型活性的质膜H+-ATPase使其气孔开度增加,干旱胁迫12h,转基因烟草的光合作用增强,但其抗干旱胁迫的能力降低。通过免疫共沉淀分析选取与14-3-3蛋白互作水平最低的质膜H+-ATPase抑制表达株系RP1为PEG处理的实验材料。在2%PEG干旱胁迫12h,RP1叶片的质膜H+-ATPase活性和氢泵活性低于WT,其保卫细胞中积累H2O2的叶绿体数量显著高于WT,而其气孔开度明显小于WT。此外,在干旱胁迫时RP1叶片中的APX、CAT、POD活性低于WT,因此其叶片中H202含量高于WT。PEG干旱胁迫12h,RP1的失水率、光合作用、气孔传导率、蒸腾速率均小于WT。这些结果说明在烟草中抑制质膜H+-ATPase的表达,使质膜H+-ATPase活性降低,气孔开度减小,因此也减少干旱胁迫下转基因烟草的蒸腾失水,从而增强烟草的耐旱能力。