研究背景和目的：糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常见的慢性并发症之一，也是导致终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）的主要原因。目前糖尿病的治疗原则主要是控制血糖、血压，饮食控制和保护肾功能，但仍有一部分患者发生DN，一旦进入临床蛋白尿期，尽管基于各种干预手段，DN患者的肾功能还是会减退，约有20-30％发展至ESRD，由此带来的透析、肾移植等治疗费用在整个医疗支出中所占比例正在逐年增长，给病人和社会造成极大的经济负担。对DN发病机制的研究既往多集中在血糖、脂代谢紊乱与血流动力学异常等方面。近年研究发现，炎症反应是DN发生、发展的重要机制。肾脏固有细胞在病理状态下可以产生转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、单核细胞趋化蛋白—1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、白细胞介素—1（interleukin-1，IL-1）等多种炎症因子，这些因子又通过自分泌和旁分泌的方式使炎症效应不断扩大，从而引起炎症级联反应。霉酚酸酯（mycophenolate mofetil，MMF）是一种新型的免疫抑制剂，是霉酚酸（mycophenolic acid，MPA）的2-乙基酯类衍生物，除了高度选择性的抑制淋巴细胞的增殖，还可抑制系膜细胞、单核细胞的增殖，减少细胞间粘附分子的表达和细胞外基质沉积。MMF最初应用于肾移植术后抗排斥反应。近年来，研究发现MMF对非炎症性肾病有明显的治疗作用。在糖尿病大鼠模型中初步发现可明显减少蛋白尿、抑制肾小球肥大及硬化，减少炎症细胞浸润，对糖尿病大鼠肾血流动力学紊乱无明显影响。但到目前为止，国内外尚未检索到有人系统探讨霉酚酸酯对早期糖尿病肾病大鼠系膜细胞及足细胞等是否具有保护作用及机制研究。本研究应用细胞培养和链脲佐菌素（strepzotocin，STZ）诱导的单侧肾切除糖尿病大鼠模型，以DN发生发展的主要介导者细胞因子为切入点，以DN的主要病理基础ECM沉积为关键环节，在体外观察不同浓度葡萄糖对肾小球系膜细胞增生的影响，并观察MMF对高糖环境大鼠肾小球系膜细胞增殖及Ⅳ型胶原的影响及可能机制；在体内观察STZ诱导的糖尿病大鼠8周时肾脏病变情况及MMF对其足细胞及肾小管间质损伤的保护作用。本研究旨在进一步探讨MMF对糖尿病大鼠肾组织的保护作用，为MMF应用于临床治疗DN提供实验依据，具有重要的理论意义和实用价值。方法：1、肾小球系膜细胞分别培养于不同糖浓度环境中，采用MTT比色法观察系膜细胞（mesangial cells，MCs）的增殖情况；选用30mmol／L葡萄糖刺激体外培养的大鼠MCs增殖，加入不同浓度的MPA（10，25，50umol／L），观察6、12、24、48h系膜细胞的增殖情况；放射免疫法测定细胞上清液中Ⅳ型胶原的含量；ELISA法测定细胞上清液中MCP-1的含量；荧光实时定量PCR法测定细胞中TGF-B、CTGF及MCP-1mRNA的表达。2、雄性Wistar大鼠行右肾切除后，腹腔注射链脲佐菌素（STZ，65mg／kg）诱发糖尿病模型。将实验动物随机分为右肾切除对照组（NC）、糖尿病组（DM），霉酚酸酯治疗组（DM.M），缬沙坦治疗组（DM.V），缬沙坦和霉酚酸酯联合治疗组（DM.V.M）；治疗组分别给予MMF15mg.kg-1.d-1，缬沙坦40mg.kg-1.d-1；联合治疗组给予缬沙坦40mg.kg-1.d-1+MMF15mg.kg-1.d-1（MMF先溶解在5％二甲基亚砜中），均用5g／L羧甲基纤维素钠配成所需浓度，1ml／d灌胃。检测各组8w末的左肾重／体重比值、24h尿蛋白（Upro）、血糖（BG）、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）及肌酐清除率（Ccr）；光镜及电镜观察肾组织形态学变化；免疫组化检测肾组织中nephrin，desmin及MCP-1表达，real time-PCR测定肾组织中nephrin及MCP-1mRNA表达。3、将实验动物随机分为右肾切除对照组（NC）、糖尿病组（DM），霉酚酸酯治疗组（DM.M，MMF15mg.kg-1.d-1），观察MMF对肾小管—间质的影响，免疫组化检测肾组织中MCP-1、OPN、M-CSF及CD68表达，real time-PCR测定肾组织中MCP-1及OPN mRNA表达。结果细胞培养：1、不同浓度葡萄糖、MMF对系膜细胞增殖的影响葡萄糖对MCs的增殖呈现浓度和时间依赖性，反应最佳浓度为30mmol／L，最佳时点为24h。MMF有抑制高糖所致MCs增殖作用，并呈剂量时间依赖性。2、细胞上清液Ⅳ型胶原含量的变化高糖使系膜细胞上清液Ⅳ型胶原含量较正常对照组增加，MMF干预可减少高糖所致系膜细胞Ⅳ型胶原含量的增加（P＜0.05）。3、系膜细胞MCP-1基因和蛋白的表达高糖可刺激系膜细胞MCP-1基因和蛋白的表达增高；MMF干预可明显抑制高糖所致系膜细胞MCP-1的高表达，随MMF浓度的增高、刺激时间的延长抑制作用增强。4、系膜细胞TGF-β和CTGFmRNA的表达正常对照培养的系膜细胞可低水平表达TGF-β和CTGFmRNA，随刺激时间的延长无明显变化；12h各组TGF-β和CTGF mRNA的表达比较无明显变化（P＞0.05）；24，48h高糖组（30mmol／L）TGF-β和CTGF mRNA的表达较前均明显增高，MCs高糖培养48h，TGF-βmRNA的表达为对照组的4.54倍，CTGFmRNA高糖组为对照组的5.65倍，MMF干预可抑制其高表达（P＜0.01）。动物实验：1．各组大鼠一般情况及血生化指标的变化：糖尿病大鼠在实验期间均表现出多饮、多尿、多食、消瘦，生长迟缓，精神萎靡，反应迟钝，毛发竖立，无光泽等症状。DM组与NC组相比，24h尿蛋白（Upro）增高，体重降低，肥大指数（左肾重／体重）增加（P＜0.01）；各治疗组与DM组相比，尿蛋白降低，体重增加，肥大指数降低（P＜0.05）；各组血肌酐、BUN改变不明显（P＞0.05），但肌酐清除率（Ccr）糖尿病大鼠比较NC组明显增高（P＜0.01），各治疗组比较DM组明显降低，以MMF治疗组改善更明显（P＜0.01）。DM组和各治疗组大鼠BG均显著高于NC组大鼠（P均＜0.01），DM组和各治疗组比较BG无显著性差异（P＞0.05）；DM组大鼠Upro显著高于NC组（P＜0.01），各治疗组大鼠Upro明显低于DM组（P＜0.05），缬沙坦及联合治疗组收缩压较DM组及MMF组降低30mmHg（P＜0.01），与NC组大鼠血压比较无明显差异（P＞0.05）。2．肾组织病理形态学变化：光镜观察：HE及PAS染色显示，8w末DM组大鼠肾小球体积增大，肾小球基底膜增厚，系膜区扩大，肾小球毛细血管腔受压变窄。与NC组比较，DM组肾小球硬化指数（GSI）及间质纤维化积分明显增加；各治疗组较DM组有不同程度的改善。24h尿蛋白定量与GSI及肾间质纤维化积分存在正相关（r₁=0.67，P＜0.01；r₂=0.74，P＜0.01）。电镜观察：NC组足突形态正常，DM组足突融合变平，可见裸露肾小球基底膜以及脱落足细胞，6BM增厚，系膜基质增多。各治疗组，肾小球足突融合减轻，少见脱落足细胞，细胞外基质减少。3．各组肾皮质nephrin、MCP-1 mRNA表达的改变：与NC组相比，DM组nephrin mRNA表达下调（78％，P＜0.05），各治疗组比较DM组nephrin mRNA表达增加，以MMF治疗组增加更明显（P＜0.01）。与NC组相比，DM组MCP-1 mRNA表达明显上调（251％，P＜0.05），各治疗组比较DM组明显降低，以MMF治疗组降低更明显（P＜0.01）。nephrin与MCP-1mRNA表达存在负相关（r=-0.86，P＜0.01）；24h尿蛋白与MCP-1mRNA存在正相关（r=0.82，P＜0.01），与nephrin mRNA存在负相关（r=-0.78，P＜0.01）。4．免疫组化法检测肾组织nephrin、desmin及MCP-1表达：NC组可见nephrin蛋白呈线性分布在肾小球，DM组nephrin表达明显减少，各治疗组nephrin蛋白表达上调。NC组大鼠肾小球内偶有desmin蛋白散在表达，MCP-1蛋白在肾小管上皮细胞可见少许表达；DM组大鼠肾小球内desmin比较NC组显著增高，MCP-1蛋白主要表达于肾小管上皮细胞，肾小球内可见少许表达；与DM组相比，各治疗组大鼠肾小球内desmin及肾小管周围MCP-1蛋白表达明显降低，以MMF治疗组改善明显（P＜0.01），但仍高于NC组大鼠。5．免疫组化法检测肾组织MCP-1、OPN、M-CSF及CD68表达：与NC组比较，DM组肾小管间质MCP-1、OPN、M-CSF及CD68表达明显增加（P＜0.01）；MMF治疗后可明显抑制MCP-1、OPN、M-CSF及CD68表达。相关性分析肾小管-间质内CD68阳性细胞数与MCP-1的表达明显相关（r=0.9867，P=0.0133），与OPN的表达也存在正相关（r=0.8356，P=0.0157）。萎缩肾小管比例及间质纤维化均与MCP-1、OPN表达存在明显正相关（P＜0.05）。6、各组肾组织MCP-1及OPN mRNA表达的改变：与NC组相比，DM组MCP-1及OPN mRNA表达明显增加（P＜0.01），MMF治疗组比较DM组表达降低（P＜0.05）。结论：1、高糖在一定浓度和时段内有刺激大鼠MCs增殖的效应，MMF对高糖所致MCs增殖具有抑制作用，且随MMF剂量增大，刺激时间的延长，抑制作用增强。2、高糖使肾小球系膜细胞趋化因子MCP-1基因和蛋白表达增高，致纤维化因子TGF-B和CTGFmRNA表达增加；MMF可抑制MCP-1的表达，降低Ⅳ型胶原的含量，下调TGF-B和CTGFmRNA表达，减少细胞外基质，对糖尿病肾病具有一定的防治作用。3、MMF及缬沙坦均能减少糖尿病大鼠肾组织中MCP-1、desmin及MCP-1mRNA的表达，上调Nephrin基因及蛋白表达，降低蛋白尿，预防肾损伤，但联合治疗不优于单一治疗。MMF对DN大鼠早期具有明显的保护作用，可能通过抗炎反应减轻足细胞损伤，减少蛋白尿，保护肾功能。4、糖尿病大鼠肾小管间质MCP-1、OPN、M-CSF及CD68的表达较对照组大鼠明显增高，进一步证实炎症反应与DN发生有关。5．MMF治疗后糖尿病大鼠肾组织MCP-1、OPN mRNA和蛋白及CD68表达明显降低，萎缩肾小管及间质纤维化明显减少，并可减轻蛋白尿，不论从基因水平还是从蛋白水平，MMF均可抑制MCP-1及OPN的表达，抑制巨噬细胞的特异性趋化和增殖，减轻炎症反应，延缓DN的进展。