论文部分内容阅读
目的:研究可溶性环氧化物水解酶抑制剂(soluble epoxide hydrolase inhibitor,sEHi)AUDA对颈动脉狭窄(carotid stenosis,CS)患者外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)的增殖、凋亡和Akt磷酸化(p-Akt)水平的影响。方法:⑴选择经数字减影脑血管造影(Digital Subtraction Angiography,DSA)确诊为CS患者40例作为CS组,另选经DSA检查正常的30例作为对照组。⑵所有入组人员于DSA术中经鞘管从股动脉抽取动脉血20 m L,采用密度梯度离心法分离出单个核细胞,再将单个核细胞以2×106/孔的密度接种到人纤维连接蛋白预包被的24孔培养板,置37℃,5%CO2培养箱中培养。培养4天后洗去非贴壁细胞,换液培养至第7天供实验用。⑶内皮祖细胞鉴定:采用流式细胞仪检测其CD34、CD133的表达;应用激光共聚焦显微镜鉴定细胞摄取乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac LDL)及结合荆豆凝集素(FITC-UEA-I)的能力。⑷采用MTT法、Annexin/PI双染法,观察CS组与对照组EPCs的增殖能力、凋亡程度的差异。⑸通过MTT法、Annexin/PI双染法,观察不同浓度(0μmol/L,0.1μmol/L,1μmol/L,10μmol/L)的AUDA对CS组EPCs增殖和凋亡的影响。⑹使用阻断剂LY29400阻断PI3K/Akt后,通过MTT法、Annexin/PI双染法和Western blot法,观察使用阻断剂前后AUDA对EPCs增殖能力、凋亡以及细胞内p-Akt的变化。结果:⑴刚分离的外周血单个核细胞呈圆形,折光好,悬浮于培养液中,培养至第4天,可见细胞体积变大,贴壁生长,呈短梭形,用PBS洗掉非贴壁细胞,培养至第7天可见大量长梭形、并呈集落样生长的EPCs。⑵流式细胞法显示EPCs表面同时表达CD34及CD133分子;在激光共聚焦显微镜下,EPCs既能显示摄取Dil-acLDL后的红色荧光,也能显示结合FITCUEA-I后的绿色荧光。⑶与对照组相比,CS患者EPCs的增殖能力下降、凋亡程度增加(P<0.05);与未处理组(0μmol/L)相比,AUDA表现出剂量依赖性地增强CS患者EPCs的增殖能力、减少其凋亡程度。⑷AUDA组较AUDA+LY294002组、LY294002组EPCs增殖能力强、凋亡程度减少(P<0.05),AUDA+LY294002组较LY294002组EPCs增殖能力强、凋亡程度减少(P<0.05),未处理组与AUDA+LY294002组相比EPCs增殖能力、凋亡程度未见明显差异(P>0.05)。⑸对照组EPCs p-Akt程度较未处理组强,AUDA组较AUDA+LY294002组、LY294002组p-Akt程度强(P<0.05),AUDA+LY294002组较LY294002组EPCs p-Akt程度强(P<0.05),未处理组与AUDA+LY294002组EPCsp-Akt程度未见明显差异(P>0.05)。结论:⑴与对照组相比,CS患者外周血EPCs增殖能力下降,凋亡程度增加。⑵AUDA可以剂量依赖性的促进CS患者EPCs的增殖、抑制其凋亡。⑶AUDA部分通过活化PI3K/Akt信号通路,促进EPCs增殖,抑制其凋亡。⑷证实AUDA具有抗颈动脉粥样硬化的作用,其有望成为一类治疗颈动脉狭窄的新型药物。