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第一部分脑外伤后脑水肿形成机制的研究 目的:通过研究大鼠脑外伤(traumatic brain injury,TBI)后,水通道蛋白4(aquaporin4,AQP4)和水通道蛋白9(aquaporins9,AQP9)在脑组织中表达变化的时空规律以及脑水肿的变化规律,探讨AQP4,9在TBI后脑水肿的形成、发展及转归中的作用,为临床治疗脑水肿提供实验依据。 方法:健康成年雄性SD大鼠651只,随机分为脑外伤组、对照组和正常组,采用改良加速冲击法制作重度脑外伤模型,对照组除不用击锤打击钉帽外,其余步骤与脑外伤组相同。每组于1、3、6、12、24、48、72 h和1周取材,采用光镜、电镜对相应部位进行病理观察,TTC(2,3,5-Tripheny1,2-H-Tetrazolum chloride)染色观察脑组织的缺血程度,伊文氏蓝(Evans Blue,EB)测定法检测血脑屏障(blood brainbarrier,BBB)的损伤程度,干湿重法计算脑组织含水量变化,免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)、免疫荧光(Immunofluorence,IF)观察各组相应时间点脑组织AQP4,9的表达变化,免疫印迹(western-blot)、PCR测定各组相应时间点脑组织AQP4,9含量的变化。 结果:在假手术对照组,脑组织形态、TTC染色、EB检测均与正常组无明显差别;术后6-12h,脑含水量增加,电子显微镜观察显示此时大脑皮质内部分星胶肿胀,以6h为甚;免疫组化、免疫双标、免疫印迹及PCR显示,术后6h,AQP4表达降低,AQP9表达增高。在TBI组中,光镜观察发现,打击处大脑皮质损伤明显,至48-72 h损伤区域明显扩大,大脑皮质组织肿胀,结构模糊不清。TTC检测显示,1-6h脑缺血灶不明显,24h缺血灶仅局限在打击处,至72 、h局部缺血灶达最大面积,但直至1w,未出现大面积缺血灶。EB检测显示,伤侧大脑EB含量于1h明显增高,6h达峰值,后逐渐递减,至72h及以后时段与对照组无明显差别。伤侧大脑皮质含水量,于伤后1 h明显增高,并于6 h含水量达到峰值,之后略有减轻,但仍明显高于对照组和正常组,72h达次峰值,直至1w仍未恢复正常水平。免疫组化及免疫荧光检测显示,AOP4于TBI早期在血管周围、软脑膜下、室管膜下表达明显增强,24 h后除上述部位外,其阳性细胞广泛存在于大脑皮质内;TBI早期可见大脑内散在的AOP9阳性细胞,24 h后其阳性星形胶质细胞广泛存在于脑内,且在下丘脑可见阳性表达的神经元。免疫印迹和PCR显示,AQP4表达于伤后1 、h明显增加,6h后有所下降,但仍明显高于对照组,之后其表达继续增加,于48-72h达峰值,直至1w仍未恢复到正常水平;AOP9的表达从伤后开始上调,于6h达次峰值,在随后的轻度下降后,再次增高,至72h达峰值,1w仍高于正常水平(P<0.05)。 结论:TBI早期,BBB严重受损造成细胞外水肿,AOP4表达改变可能与细胞外液清除有关,AOP9表达的上调可能与应激反应和细胞水肿有关。此时期以细胞外水肿为主,同时存在细胞水肿。TBI继发损伤期,BBB损伤逐渐减轻,AQP4表达上调与细胞水肿的形成有关,AQP9在此期的表达上调可能与能量代谢的调节和细胞水肿的形成有关。此时脑水肿以细胞水肿为主,兼有细胞外水肿。 第二部分 AQP4锚定机制的研究 目的:探讨AQP4与其锚定蛋白的表达及分布变化之间的关系,初步研究TBI后AQP4锚定机制的改变与外伤性脑水肿的关系。 方法:成年健康雄性SD(sprague-dawley)大鼠186只,随机分为脑外伤组和对照组,采用改良加速冲击法制作重度脑外伤模型,对照组除不用击锤打击钉帽外,其余布步骤与脑外伤组相同。每组于1、3、6、12、24、48、72 h和1周取材;新生SD大鼠(2d内)84只,取大脑皮层进行星形胶质细胞原代培养,随机分为对照组和划伤组,每组分别于1、3、6、12、24、48、72 h取材。通过HE、尼氏染色观察脑外伤后离体和在体模型的病理变化。用免疫荧光标记法检测AQP4及其锚定相关蛋白α-syntrophin,laminin,Agrin在TBI后脑组织及划伤后星形胶质细胞的表达及分布变化。用免疫印迹法检测AQP4及其锚定相关蛋白α-syntrophin,laminin,agrin在TBI后大脑皮质及划伤后星形胶质细胞的表达变化。 结果:在体实验中,对照组AQP4于TBI后6 h在伤侧皮质表达降低,其锚定相关蛋白的表达变化无明显异常。TBI组中,免疫荧光显示AQP4、α-syntrophin于TBI早期(1-12 h),在血管周围、软脑膜下、室管膜下表达明显增强,24 h后除上述部位外,其阳性细胞广泛存在于大脑皮质内,二者共表达;laminin,agrin于TBI早期,在脑内部分血管周围、软脑膜及室管膜下区域表达明显增强,24 h后可见大脑皮质内星形胶质细胞的阳性表达,且与AQP4共表达。免疫荧光及免疫印迹显示,AQP4及其锚定相关蛋白表达变化规律基本一致,均于TBI后1-3 h明显增加,6 h表达下调,随后逐渐增加,至48-72 h达峰值,1 w仍高于正常组;AQP4与其各个锚定相关蛋白之间均呈正相关。离体实验中,光镜观察显示,划伤后星形胶质细胞轴突断裂、细胞破裂。免疫荧光显示,AQP4、laminin、agrin在划伤后3 h表达明显增高,且随时间延长而递增,三者共表达于胞膜,12 h后,于足突断端可见三者表达较胞膜明显增高;α-syntrophin表达于星胶的胞浆或/和胞核内,12 h后其表达明显增强,其部分阳性细胞与AQP4共表达。免疫荧光及免疫印迹显示,AQP4、laminin、agrin在划伤后3 h明显上调,之后逐渐增高,至48-72 h达峰值;α-syntrophin在划伤后3 h表达下调,6 h恢复至正常水平,之后逐渐增加,至48 h达峰值。 结论:TBI后,AQP4及其锚定相关蛋白α-syntrophin、laminin、agrin的表达分布均发生改变;AQP4锚定机制的改变与AQP4的表达及分布改变,以及脑外伤后脑水肿的形成有关。