我国是国际上天然药用资源最为丰富的国家之一，有着悠久的中草药应用历史和丰富的动植物资源。其中当归是我国传统的一味中药，多选自我国甘肃岷县的道地药材伞形科草本植物当归（Angelica sinensis(Oliv.)Diels）的干燥根茎，是用于补血活血的重要传统中药。当归多糖（Angelica sinensispolysaccharide）是从当归根饮片中提取的主要活性成分，具有多种药理活性。近年来研究报道已经表明当归多糖具有保肝护肝、抗贫血、调节糖脂代谢紊乱等药理作用。本课题组前期一直致力于当归多糖药理药效作用的研究，但是关于当归多糖的体内过程研究还处于探索阶段。本课题旨在合成一种当归多糖的近红外荧光标记物，利用标记物的近红外荧光成像和组织荧光信号追踪当归多糖口服后在体内的吸收情况及其吸收机制。　　本课题选择甘肃岷县当归根饮片为原材料，采用水提醇沉法提取，冻融和透析实现初步纯化，经过G50凝胶柱进一步分离得到精制当归多糖组分。精制当归多糖通过一系列分析方法进行质量评价。在合成当归多糖羧基衍生物的基础上完成当归多糖近红外荧光素Cy5.5的标记。通过体内近红外荧光成像和结扎肠循环模型，以及体外Ussing Chamber模型和Caco-2细胞单层模型研究当归多糖的口服吸收及其机制。最后，本课题进一步研究验证了当归多糖的肝靶向活性，这是前期研究的深入和延续。本课题不仅阐明了当归多糖口服后的吸收情况和具体机制，为其临床应用提供了理论依据；还有助于阐明中药当归发挥药理药效的物质基础，对当归营养和保健价值的进一步发掘和利用有着重要的实践意义，并且有益于祖国传统中医药的传承与发扬。本文分为几个部分:　　第一部分当归多糖的提取、纯化与鉴定　　制备精制当归多糖采用本课题组前期已建立并优化的一条绿色环保的提取纯化工艺：首先通过水提醇沉法提取当归粗多糖后，依次经过反复冻融，Mw3500透析袋透析完成初步纯化工序。随后采用G50凝胶柱分离，用真空冷冻干燥机干燥后即得到精制当归多糖组分。　　对提取的精制当归多糖组分进行质量控制和初步结构鉴定：硫酸苯酚法测得精制当归多糖组分的糖含量为92%左右，HPGPC法测得精制当归多糖组分的重均分子量为89000Da，紫外扫描图谱表明精制当归多糖中几乎不含有蛋白质和核酸，红外扫描吸收图谱出现了多糖结构的特征吸收峰，明确了提取的物质具有多糖基本结构。　　该部分实验中提取的当归多糖糖含量较高、分子量均一稳定、几乎不含核酸和蛋白质等杂质，为后续实验奠定了物质基础。　　第二部分当归多糖近红外荧光素Cy5.5标记物的制备、纯化与鉴定　　目前生物样品中多糖的微量检测技术的缺乏是多糖体内过程研究的主要瓶颈。当归多糖因其结构中既无吸光基团，又无发色基团，难以用紫外或者荧光检测器等常规检测手段进行检测。Cy5.5是用于标记多肽、蛋白和寡核苷酸的常用活性染料。因此在本部分实验中，选取Cy5.5作为近红外荧光染料来标记当归多糖。当归多糖结构中富含羟基，利用羟基与丁二酸酐（SAA）反应形成当归多糖羧基衍生物，透析后冻干即得纯化后的当归多糖的羧基衍生物（ASP-SA）。利用FTIR，1H-NMR验证了ASP-SA的结构。当归多糖的羧基衍生物合成成功后，利用Cy5.5azide结构中的氨基与活化的当归多糖羧酸衍生物反应转化为当归多糖近红外荧光结合物。经过透析和多次过滤离心去除未反应的Cy5.5后冻干得到当归多糖的荧光标记物（cASP）。通过FTIR、1H-NMR验证cASP的结构。ASP-SA的FTIR图谱结果显示在1725cm-1处出现一个强的吸收峰，归属为羰基（-C=O）的特征吸收峰。cASP的FTIR图谱结果显示3328cm-1是羟基（-OH）与氨基（-NH2）的特征吸收峰，1725cm-1是羰基的特征吸收峰（-C=O），1646cm-1处归属为仲酰胺Ⅰ带-C=O的伸缩振动峰，1566cm-1处则是仲酰胺Ⅱ带：-NH的变形振动峰和-C-NH的伸缩振动峰。ASP-SA的1H-NMR图谱中，既出现了ASP糖环的特征位移（3.0-5.5ppm），同时也出现了丁二酸酐中亚甲基结构的特征位移（2.3-2.6ppm）。在cASP的1H-NMR中，ASP的特征位移依然存在，而ASP-SA中的亚甲基结构的特征位移（2.3-2.6ppm）消失，在6.0-8.5ppm处出现了Cy5.5的特征位移，表明ASP-SA与cASP合成成功。Cy5.5荧光团可以与很多的仪器如荧光显微镜、成像仪、激光共聚焦显微镜、荧光分析仪等相兼容，标记后的荧光标记物可以用于活体成像，组织分布等研究。　　第三部分当归多糖口服吸收机制研究　　本部分在当归多糖荧光衍生物合成的基础上研究其口服吸收与吸收机制。首先，使用近红外荧光成像来研究cASP口服后的吸收和分布情况。分别进行了活体成像，胃肠道离体组织成像以及其他离体组织成像。近红外荧光成像结果表明cASP口服后可以通过小肠吸收，其中吸收主要发生在回肠，然后进入血液循环分布到各个器官。采用Ussing chamber法研究cASP在离体十二指肠、空肠和回肠的吸收情况。通过实验结果绘制转运时间-单位膜面积的累积转运量曲线，并计算Papp值。实验结果说明，整个小肠段都有吸收，空肠和回肠的吸收较十二指肠更多，其中回肠是cASP的优势吸收肠段。然后采用结扎肠循环模型来研究cASP的在体肠吸收情况。结果显示cASP在整个小肠段都有吸收，在十二指肠和空肠处，cASP被肠道高粘弹性粘液屏障阻碍，主要吸附在肠上皮绒毛上，而在回肠中，可以看到一定量的cASP可穿透粘液屏障并到达基底外侧膜，说明回肠中cASP的吸收量高于十二指肠和空肠，这与近红外荧光成像和Ussing chamber实验结果一致。　　选择Caco-2细胞作为研究小肠上皮细胞的药物转运、吸收和代谢的体外模型。首先通过MTT实验和LDH实验考察cASP对Caco-2细胞的毒性。MTT实验结果说明cASP不会对Caco-2细胞造成毒性，LDH实验结果说明cASP并不会破坏Caco-2细胞膜的完整性。接着通过加入不同细胞途径的抑制剂（内吞途径抑制剂和细胞内转运途径抑制剂）考察了cASP的出胞和入胞过程。结果说明，当归多糖在Caco-2细胞中的摄取是一个时间和能量依赖过程，主要通过小窝蛋白/脂筏结构，网格蛋白结构和巨胞饮途径介导的内吞完成，同时肌动蛋白微丝结构也在Caco-2细胞摄取当归多糖的过程中发挥着一定的作用。当归多糖的摄取入胞和细胞内转运是两个相对独立的过程；内质网、高尔基体和微管蛋白在其出胞过程中发挥着重要的作用，通过这些细胞器的转运，使得当归多糖最终实现出胞转运。　　体外构建Caco-2细胞单层模型模拟小肠上皮细胞单层用于研究cASP的跨膜转运吸收情况以及机制。首先考察了cASP的跨膜转运随时间变化的规律。结果说明当归多糖在Caco-2细胞单层的跨膜转运是一个复杂且困难的过程，整个过程是跨上皮细胞的转运，而不是打开紧密连接结构进行转运的。接下来通过加入不同内吞途径抑制剂来详细研究cASP在Caco-2细胞单层中的转运机制。结果说明cASP的跨膜转运是小窝蛋白/脂筏结构和网格蛋白结构介导的转运过程，同时巨胞饮途径和肌动蛋白骨架系统也在cASP的跨膜转运过程中发挥着重要的作用，整个过程都是能量依赖的。　　第四部分当归多糖肝靶向作用研究　　课题组前期对当归多糖进行了核素锝标记，借助单光子发射计算机断层成像术/电子计算机断层扫描（SPECT/CT）采集成像，研究了当归多糖的肝靶向性。在当归多糖近红外荧光标记物cASP合成的基础上，希望借助近红外荧光成像方式进一步验证当归多糖的肝靶向性。通过近红外荧光活体成像和离体组织成像证明了肝脏是当归多糖的主要聚集器官。去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）是肝脏定向转运的最佳受体，结合当归多糖主链结构主要是由半乳糖组成的结构特点，推测当归多糖是通过ASGPR介导途径进入肝脏实现靶向活性。因此设计NGA拮抗实验进一步探讨当归多糖摄取进入肝脏的方式。通过NGA拮抗实验发现拮抗组的肝脏荧光强度减弱，肾脏则明显增强，说明NGA对当归多糖进入肝脏具有一定的拮抗作用，表明当归多糖可以通过ASGPR介导进入肝脏。