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神经干细胞具有自我更新的能力，通过非对称分裂的方式生成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等，组成神经组织，对神经退行性疾病的治疗、神经损伤修复和神经再生与功能重建具有潜在的应用价值。神经干细胞分化涉及复杂的信号途径，在这个过程中，细胞内多条信号转导通路的关键分子－Rho-GTP酶通过与其下游效应元件的作用调节神经细胞肌动蛋白骨架的重组，广泛的参与神经细胞的生长、分化、迁移等。鸟苷酸解离抑制因子（guanine nucleotide dissociation inhibitor，GDIs）在调节着Rho-GTP酶的活性过程中具有重要作用。Rho-GDIγ特异性的表达于正在发育或者成熟的脑的大脑皮层，纹状体和海马区，基于本实验室的前期基因表达芯片和RANi靶向下调Rho-GDIγ的研究表明，Rho-GDIγ与神经干细胞分化有关，但是对于其调节神经干细胞分化的机制却不清楚，本研究结合了系统生物学技术和生物实验技术探讨了Rho-GDIγ介导的神经干细胞分化调控网络。本研究首次发现转录因子（HNF4-1）和（MAZ-1）对Rho-GDIγ的调控作用。通过EMSA、转录因子圈套方法证实HNF4-1和MAZ-1靶向Rho-GDIγ启动子区域并能够调节Rho-GDIγ的表达，结果表明Rho-GDIγ的沉默促使神经干细胞在形态上发生了显著的变化，神经突起明显伸长，免疫组化证实具有向神经元方向分化的趋势；体外迁移实验证实神经干细胞的迁移能力明显增强；将HNF4-1和MAZ-1转录因子圈套序列显微注射入小鼠体内的海马区域，结果表明显微注射点区域HNF4-1和MAZ-1下调Rho-GDIγ表达；3周和7周后的行为学实验表明，HNF4-1和MAZ-1对小鼠的空间学习和记忆能力没有明显的影响。研究结果表明HNF4-1和MAZ-1转录因子圈套能够下调Rho-GDIγ的表达，促进神经干细胞向神经元方向分化，但是对小鼠的空间学习和记忆能力没有明显的影响。进一步通过计算系统生物学和生物实验技术，构建、证实了Rho-GDIγ介导的神经干细胞分化调控网络。首先构建了神经干细胞中蛋白质功能作用网络，并将其与基因表达数据整合，利用最短路径模型预测了Rho-GDIγ介导的神经干细胞的分化网络；生物学实验Real Time PCR分析了在Rho-GDIγ的下调和过表达的情况下，分化调控网络中的相关基因的表达量变化，这些表达量的变化证实了Rho-GDIγ对此神经干细胞分化网络的调控作用。最后，通过Real Time PCR和Westernblotting生物学实验表明，Rho-GDIγ可能通过调节信号通路Vcp, Mapk8, Ywhae和Ywhah的表达，最终促进神经干细胞的分化。计算系统生物学和生物实验的有效结合表明了神经干细胞分化调控网络的可预测性和系统生物学技术对于鉴定神经干细胞分化调控网络的有效性，为神经干细胞分化及其调控机制的研究奠定了基础。磷脂在细胞膜分布的不对称性是生物膜完成复杂的在时空上有序的各种生理功能的重要结构基础，P4型ATP酶能够调节磷脂的内翻，是维持细胞质膜中磷脂不对称分布的一种新型酶。P4型ATP酶的缺失和突变常常伴随着严重的病理学反应。在哺乳动物中，14种P4型ATP酶通过与相对保守的３种β亚基CDC50家族蛋白相互作用来调节其功能。本研究结合了免疫亲和层析技术和高敏感性的质谱技术，鉴定了不同组织中与CDC50Ａ相互作用的P4型ATP酶，对于研究其结构、定位、功能及其与疾病的关系具有重要意义。我们的实验结果首次表明，视网膜中分布５种P4型ATP酶与CDC50Ａ相互作用，睾丸中存在8种，而脑组织中仅存在２种P4型ATP酶与其作用。其中，前期研究结果已经表明ATP8A1在脑中高表达，ATP8A2存在于视网膜中。首次鉴定了ATP11家族成员分布于视网膜和睾丸中；ATP8A1, ATP8A2, ATP8B3, ATP8B4和ATP10A富集于睾丸中，表明了P4型ATP酶可能对于精子发生和精子代谢的重要作用；ATP8A2广泛存在于脑，睾丸和视网膜中。Western blotting和免疫荧光染色进一步鉴定了这些新型P4－ATP酶在脑，睾丸和视网膜组织中的定位。进一步为了研究CDC50A在细胞中的定位和生物学的功能，我们克隆并表达了在视网膜中和睾丸中与CDC50A相互作用的ATP11A和ATP11C两种未定性的蛋白，制备了其相应的多克隆或单克隆抗体。免疫共沉淀结果表明ATP11A和ATP11C都与β亚基CDC50A和CDC50B存在相互作用。免疫荧光结果表明ATP11A, ATP11C与CDC50A或CDC50B共表达时，ATP11A, ATP11C定位于高尔基体；相比而言，当缺乏β亚基CDC50表达时，大部分ATP11A, ATP11C定位于内质网，无法迁移至高尔基体。酶促反应动力学常数表明，ATP11A和ATP11C定向内翻磷脂酰丝氨酸。综上所述，结合蛋白质组学结果表明P4型ATP酶与CDC50A相互作用，并且催化脂双层的特异性的脂类在两层之间翻转，这在膜的发生和功能维护上具有重要的意义。本研究中P4型ATP酶在不同组织中的鉴定及对于ATP11A和ATP11C的定性研究为进一步阐释其结构，功能及其与疾病的关系提供了重要的值得借鉴的依据。