多环芳烃(PAHs)是一类广泛存在环境中的典型持久性有机有毒污染物。大多数的多环芳烃具有“三致”作用,通过食物链的传递会对生态环境和人体健康造成极大危害,因而这类化合物引起了人们的关注。生物修复特别是利用微生物降解被认为是去除环境中PAHs的主要途径,具有处理形式多样、成本低、对环境影响小等优点。尽管目前已发现环境中存在许多可降解PAHs的微生物,但也存在一些问题：一些以某种PAHs为唯一碳源筛选出来的单一优势菌种往往只能降解特定类型污染物且微生物活性受各种环境因素(如温度、酸度、盐度和湿度)的影响较大；或者将几种优势菌简单的混合构建高效菌群,多种菌的优化组合是一个很复杂的课题,这样的菌群有时因为种间的抑制作用很难实现作用最大化,有些菌株代谢PAHs的途径中产生了比母本毒性更高的中间产物。因此,如何获得高效降解PAHs的、作用底物范围广、环境适应性更强、具有积累少甚至不积累有毒中间代谢产物降解途径的菌株是值得研究的课题,将有助于提供PAHs污染环境的生物修复为此,本论文的主要目的是期望获得环境适应能力强,能高效降解PAHs,并且具有积累有毒中间代谢产物较少的降解途径的一个新菌种。具体研究内容包括：以原生质体融合技术为基础,通过使用环境中重要的污染物降解者——假单胞菌(Pseudomonas sp)和鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp)(二者皆为革兰氏阴性菌)作为亲本进行融合,研究了原生质体形成和再生的最佳条件、融合的方法和筛选鉴定融合子的方法；通过和不同菌种包括亲本对比降解PAHs的效果研究,分析了融合菌株的高效降解性能和环境的广泛适应性；通过研究融合菌株降解不同底物及多种PAHs的性能、代谢途径及代谢产物的产生和积累的影响,探讨了其降解PAHs的机理。主要研究结果如下：(1)确定了亲本GP3A (Pseudomonas sp)和GY2B (Sphingomonas sp)原生质体最适形成和再生条件。选择对数生长期的菌体,经过青霉素G钠和EDTA的预处理,可以更容易地得到原生质体。当酶解温度为37℃,酶解浓度为5mg/L, GP3A的酶解时间为100min, GY2B的酶解时间为80min时,GP3A和GY2B的原生质体形成率最高。采用轻微摇动的酶解方式时菌株的原生质体形成率和再生率明显比水浴静置的方式时菌株的原生质体形成率和再生率高。添加一定浓度的Mg2+, Ca2+和L-丝氨酸有助于原生质体的再生。采用夹层培养方式的再生率明显高于单层培养和混合培养方式的再生率。(2)结合抗药性实验和菲、芘的初步降解实验筛选了融合子并进行了形态学和分子生物学鉴定。通过对GP3A和GY2B进行抗药性研究,发现利用80μg/ml哌拉西林+80μg/ml头孢他啶或80μg/ml哌拉西林+(100～150μg/ml)红霉素的再生培养基可以筛选出融合子；进一步利用含有菲或芘的平板筛选出对菲和芘都有降解效果的融合子,再对这些融合子进行初步生物降解摇瓶实验,最后筛选出一株对菲和芘降解效果较高的融合子,并将其命名为F14。通过平板菌落形态、电子显微镜与扫描电子显微镜(SEM)观察和分子生物学技术PCR-RFLP分析鉴定出融合菌株F14与亲本菌株GP3A和GY2B为不同的菌种,是二者的融合子。(3)F14降解菲、芘及混合PAHs的研究。F14可以将初始浓度为100mg/L的菲在24h降解99%以上,通过对比其它菌包括亲本GY2B,发现F14具有较高的降解菲的能力。F14在温度为20-40℃和pH为6.5-9的范围内对菲都有很好的降解效果。通过非竞争性抑制动力学方程对各初始浓度S0及对应比降解速率Rxo进行非线性拟合,得到的动力学参数降解动力学常数k=134.77mg菲g X-1h-1,饱和系数Ks=77.50mg/L,抑制系数KsI=742mg/L。较大的k和KSI值表明融合菌株F14对菲具有快速降解以及能耐受高浓度菲的抑制作用的能力。F14对初始浓度为15,50和100mg/L的芘在第10d的降解率分别为46%,37.1%和18%。芘的降解速率常数(k1)随着浓度的增加下降,芘降解速率常数和初始浓度有很好的线性关系。当菲和芘一起存在时,和单独降解菲和芘比较发现菲的存在对芘的降解有促进作用而芘的存在对菲有抑制的作用。F14具有和亲本GY2B不同的菲降解途径。F14降解菲的代谢途径有两条：在双加氧酶的作用下,菲开环生成cis-3,4-phenanthrenedihydrodiol和cis-1,2-phenanthrenedihydrodiol然后分别转化为phenanthrene-3,4-diol和phenanthrene-1,2-diol。Phenanthrene-3,4-diol开环生成1-羟基-2-萘酸,再脱羧形成1-萘酚,开环后生成乙酰水杨酸。Phenanthrene-1,2-diol开环生成2-羟基-1-萘酸甲酯,再转化为乙酰水杨酸。乙酰水杨酸再生成水杨酸,然后通过邻苯二酚最后进入三羧酸循环(TCA)彻底降解为CO2和H2O。经过2-羟基-1-萘酸甲酯代谢是主要的代谢途径,2-羟基-1-萘酸的毒性比1-羟基-2-萘酸小,F14在降解菲的过程中积累的有毒的中间代谢产物少。F14降解混合的菲和芘,检测到了一种芘中间代谢产物4,5-二氢芘。F14能够利用一定浓度的萘,水杨酸,2-羟基-1-萘酸和邻苯二酚为唯一碳源和能源进行生长和繁殖。芘的存在和芴、蒽、菲的存在对苊的降解有促进作用。其它三种三环芳烃的存在能分别促进蒽和芴的降解,芘的存在和其它六种PAHs的同时存在则分别对蒽和芴的降解有抑制作用。其它低环的多环芳烃的存在能够促进对芘的降解。F14对萘,菲和芘的混合,苊,蒽,菲和芴的混合,萘、苊、蒽、菲、芴、荧蒽和芘的混合都有一定的降解效果。