目的：多重耐药性结核分枝杆菌(MDR-TB)和广泛耐药性结核分枝杆菌(XDR-TB)的出现是近些年来结核病死灰复燃的最主要原因之一。克服这种多重耐药性成了预防和控制结核病蔓延的核心问题。结核分枝杆菌(Mtb)产生耐药性的机制主要可分为获得性耐药、天然耐药两种。其中获得性耐药的产生机制可能主要是由于相关基因的突变引起的:天然耐药机制主要涉及以下的两个方面:(1)分枝杆菌细胞壁的通透性障碍;(2)活跃外排泵系统。我们所关注的就是结核分枝杆菌天然耐药机制中的药物外排抗原,以其作为药靶,以期获得针对这一类耐药菌的有效的亚单位疫苗。　　 本研究通过一系列的体内及体外的实验,筛选鉴定出与结核分枝杆菌耐药相关的药物外排抗原的HLA-A2限制性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位,并根据筛选鉴定的表位结果,进行相关多表位疫苗的设计构建。　　 第一部分、表位的筛选与鉴定　　 1.通过生物信息学软件对备选结核分枝杆菌耐药相关的药物外排抗原进行HLA-A2限制性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位进行预测;　　 2.标准Fmoc法进行多肽的合成、高效液相色谱(HPLC)纯化、电喷雾电离质谱(ESI-MS)鉴定;体外实验:　　 3.固相酶联免疫斑点技术(ELISPOT)检测表位肽诱导的外周血单个核细胞(PBMCs)IFN-γ的释放;　　 4.LDH法检测CTL活性;　　 体内实验:　　 1.免疫表位肽的HLA-A2.1/Kb转基因小鼠脾细胞分离;　　 2.ELISPOT检测表位肽诱导的小鼠脾细胞IFN-γ的释放;　　 3.LDH法检测CTL活性;　　 4.小鼠生理指标测定。　　 第二部分、多表位疫苗的构建　　 1.表位肽的选取;　　 2.多表位序列的优化;　　 3.多表位合成及质粒构建。　　 结果：　　 第一部分、表位的筛选与鉴定　　 1.利用SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL在线预测软件预测HLA-A2限制性CTL,表位。预测筛选出6个候选抗原的21个HLA-A2限制性CTL优势表位。　　 2.通过固相合成的方法成功合成16条表位肽。　　 3.体外ELISPOT结果显示有6条表位肽在不同志愿者中呈现出相对较好的IFN-γ的释放。　　 4.LDH结果显示,当效靶比是50∶1时,Rv2937-p168、Rv2937-p266、Rv2686c-p151、Rv2686c-p181、Rv2686c-p184、Rv3065-p28所诱导ppD+健康志愿者产生的CTLs的细胞裂解率分别为:30％、29%、43%、33%、27%、22%。　　 5.体内ELISPOT结果显示有6条表位肽在HLA-A2.1/Kb转基因小鼠中呈现出相对较好的IFN-γ的释放。　　 6.体内LDH结果显示,当效靶比是80∶1时,Rv2937-p168、Rv2937-p266、Rv2686c-p151、Rv2686c-p181、Rv2686c-p184、Rv3065-p28所诱导的HLA-A2.1/Kb转基因小鼠脾淋巴细胞裂解率分别为:14%、16%、23%、15%、8%、38%。　　 7.小鼠各项生理指标基本正常,未见明显毒性。　　 第二部分、多表位疫苗的构建　　 1.选取6个目前研究较多的Ag85复合物、EAST-6的HLA-A2限制性CTL表位,加上已鉴定出的6个药物外排抗原表位,整合Th表位PADRE在前端加上导向序列。各部分之间用RVICR连接子连接。　　 2.为了更为有效的引起强烈的免疫反应,在多表位序列的后端,重组进Mtb来源的HSP70蛋白的C末端序列。　　 3.通过公司合成和质粒构建,成功完成多表位疫苗的构建。　　 结论：　　 1.通过一系列的体内、体外实验,成功筛选鉴定出来自药物外排抗原的6个HLA-A2限制性CTL表位。　　 2.根据表位鉴定的结果,通过合理的多表位设计方案成功构建多表位疫苗。