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我国海洋中蕴含着充足的生物资源,由于生存环境的特殊性,海洋生物体内多糖的合成过程与陆地生物存在差异,产生了很多结构新颖,具有特殊生理功能的活性物质。现研究表明,海洋多糖因具有多种生物活性将可能作为药物中有效成分克服某些疑难病症。随着对海胆多糖结构研究的不断深入,人们开始关注海胆多糖的生物功能及其药理活性,并在抗肿瘤、调节免疫活性等方面取得初步进展。虾夷马粪海胆(Strongylocentrotus intermedius)生殖腺多糖(SUP)通过结构解析,表明其分子量小,结构简单稳定,活性高,可能具有促进细胞成熟分化的功能。在此基础之上,本实验研究SUP协同重组人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)对体外培养小鼠颅顶前成骨细胞(MC3T3-E1细胞)成骨分化活性的影响。采用复合酶法、乙醇沉淀法以及超滤分级法提取海胆生殖腺多糖,用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化法分析其单糖组成。以MC3T3-E1细胞模型测试SUP协同成骨活性能力,以不同浓度的SUP作用于MC3T3-E1细胞,用MTT法、BCIP/NBT组织染色法、茜红素染色法以及Elisa法分别对MC3T3-E1细胞的增殖率、碱性磷酸酶(ALP)活性、矿化结节以及骨钙素含量进行检测。采用免疫荧光法检测BMP-2与细胞的结合能力,Western Blot法检测MC3T3-E1细胞成骨分化相关蛋白BMP-2和Runx-2的表达,最后通过SPSS软件统计分析SUP协同BMP-2调控MC3T3-E1细胞增殖和分化的作用。经复合酶法、乙醇沉淀法及超滤分级法提取制备的SUP,分子量在3.5-5 kD之间,经1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化法分析由甘露糖(Man),氨基葡萄糖(GlcN),葡萄糖(Glc)三种单糖组成。MC3T3-E1细胞经SUP诱导后细胞呈多种形态,细胞胞浆突起明显,细胞连接紧密,可以重叠生长。MTT法检测发现1 μg/mL,5μg/mL,10 μg/mL,25μg/mL,50μg/mL,100 μg/mL 浓度的 SUP 作用 MC3T3-E1 细胞24h-120h后均能促进细胞增殖的作用。BCIP/NBT组织染色法测定MC3T3-E1细胞成骨分化早期标志物ALP活性,结果表明SUP和BMP-2联合作用比BMP-2蛋白单独作用时ALP活性表现出显著增强的现象,并且SUP浓度为10μg/mL,BMP-2浓度为100 ng/mL时ALP活性达到最强,矿化期则通过茜素红染色和检测骨钙素含量也验证了这一结果。经免疫荧光法分析发现,在此浓度下,BMP-2蛋白与细胞的结合能力达到最强,说明SUP可以延长BMP-2蛋白的半衰期,使之与细胞表面受体的结合能力增强,并且结合能力的大小受SUP的浓度调控。最后,从蛋白水平分析MC3T3-E1细胞成骨分化相关蛋白BMP-2和Runx-2的表达,Western Blot结果显示SUP对BMP-2和Runx-2蛋白的表达具有促进作用,进一步说明SUP与BMP-2蛋白联合作用后可以促进BMP-2信号通路下游信号分子的表达。实验表明,SUP协同BMP-2蛋白调控BMP-2信号通路中各信号分子可以促进MC3T3-E1细胞增殖、早期分化及钙化。这一发现表明海胆多糖可以促进成骨细胞的成熟分化,具备作为一种新型功能性食品开发利用的潜力,为辅助骨质疏松、骨折等症的预防或缓解提供一种新的思路。