论文部分内容阅读
BHV-1、BHV-5属于疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科、水痘病毒属。BHV-1目前在世界范围内流行,除南美部分国家之外,世界各国都已分离到该病毒。该病毒引起以鼻气管炎、高热、流产、眼结膜炎、传染性脓疱为特征的呼吸道疾病,还可引起外阴道炎、普遍的全身感染,每年给养牛业带来的损失超过10亿美元。BHV-5能够引起牛致命性脑膜脑炎。BHV-5能进入中枢神经系统(CNS),能够引起小牛严重的致死性的脑膜脑炎,引起成年牛亚临床症状,给养牛业造成很大的损失。gG是BHV的主要囊膜糖蛋白之一,它在α疱疹病毒中相对保守,gG可影响病毒在宿主细胞内有效增殖与细胞间扩散,在体外与病毒在细胞间侵染有关,并且可以阻止细胞的凋亡,但BHV-1 gG和BHV-5 gG的趋化能力是否有差异还不明确,BHV-5 gG胞外区能够和趋化因子结合,但具体的功能域尚不清楚。本研究构建了几个突变株,通过动物试验探讨gG对BHV-5致病性的影响。利用杆状病毒表达系统分段表达了BHV-5 gG片段,进一步通过做趋化试验,探讨BHV-1 gG和BHV-5 gG的趋化能力的差异以及BHV-5 gG具有趋化功能的区域。主要工作包括：1.突变株的构建本试验以牛疱疹病毒5型全基因组(基因登录号为AY261359)为模板,设计引物,PCR扩增gG基因上游约1.0kb和下游1.1kb的片段作为同源重组臂,分别克隆到pMD18-T载体上。用相应的限制性内切酶将下游同源臂片段回收,定向插入到含有上游同源臂片段的载体中,构建中间转移载体,命名为pZF09-13。然后在上下游同源臂中间插入带有完整启动子的EGFP报告基因,构建重组转移质粒,命名为pZF09-14。将pZF09-14线性化,回收含有上下游同源臂的序列,并将其与质粒pBICPO和BHV-5基因组DNA用磷酸钙转染法在MDBK上共转染,成功地进行了同源重组,经过4轮筛选和纯化获得了BHV-5△gG/EGFP突变株。用同样的方法成功构建BHV-5△gG/EGFP回复突变株和BHV-1△gG/EGFP回复突变株。2.BHV-5 gG表达系统的建立将BHV-5 gG的蛋白序列用软件分析,分为三段,分别设计引物,以pZF09-40为模板扩增各片段,将各片段分别克隆到pMD18-T载体上,经测序鉴定后,原核表达系统表达,并用western验证。再用限制性内切酶酶切回收,克隆到pFastBacTM1载体,提取重组的bacmid,转染sf9细胞,用PCR验证重组杆状病毒gG基因的插入,再感染High-five细胞,经western验证,gG片段得到表达。gGl大小为27KD,gG2未表达,gG3大小为55KD。3.趋化试验将BHV-5 wt、BHV-5△gG/EGFP、BHV-5△gG/EGFP rev、BHV-1 wt、BHV-1△gG/EGFP、BHV-1△gG/EGFP rev按1个MOI接种MDBK细胞,24h后,收获上清,作为趋化反应样品,将样品与趋化因子同时加到趋化小室中,作用30min,在上面小室中加中性粒细胞,45min后,计算趋化小室中的细胞数,BHV-1和BHV-5组内的三株病毒的趋化性无明显差异。按上述方法检测BHV-5 gG蛋白不同区段与趋化因子结合的能力,结果表明gG2结合能力较强。4.动物试验试验以新西兰白兔为动物试验模型,分两组,一组用BHV-5wt接种,另一组用BHV-5△gG/EGFP接种。每天观察动物神经症状,结果7dpi时BHV-5wt组和BHV-5△gG/EGFP组都出现神经症状,表明在急性感染期gG缺失对BHV-5的毒力没有影响。