论文部分内容阅读
本研究首次构建了PRV-PPV-JEV检测基因芯片,建立了PRV、PPV和JEV基因芯片检测新技术,该基因芯片技术对PRV、PPV和JEV具有同步检测和鉴别诊断,同时对PRV的野毒株和基因缺失疫苗株也具有鉴别功能。主要内容为以下几个部分: 1.PRV-PPV-JEV检测基因芯片靶基因克隆及鉴定 对PRV、PPV和JEV进行病原分子生物学分析,参考GenBank和文献中报道的PRV、PPV和JEV基因序列,采用Array Designer2.0软件分别设计了PRV、PPV和JEV靶基因引物。采用PCR或RT-PCR扩增靶基因扩增获得16个靶基因片段,用pMD18-T克隆和筛选获得了T/gB、T/gG、T/TK、T/gE、T/B1 NS1、T/B1 VP2、T/SR-1 NS1、T/SR-1 NS2、T/SR-1 NS3、T/SR-1 VP1、T/SR-1 VP2、T/C、T/PrM/M、T/E、T/NS1、T/NS5靶基因重组质粒。经序列测定和对位排列分析,结果为gB、gG、gE、TK靶基因扩增自PRV Fa株,分别为PRV gB、gG、gE、TK基因片段,片段长度分别为324bp、261bp、148bp、177bp;PPV靶基因B1 NS1、B1 VP2扩增自PPV B1株,SR-1 NS1、SR-1 NS2、SR-1 NS3、SR-1 VP1、SR-1 VP2扩增自PPV SR-1株,片段大小分别为127bp、471bp、208bp、550bp、389bp、209bp、471bp;JEV C、PrM/M、E、NS1和NS5靶基因扩增自JEV SA14-14-2株,分别为JEV C、PrM/M、E、NS1和NS5基因片段,片段长度分别为238bp、451bp、439bp、476bp和448bp。多重序列比对和BLASTN分析进一步表明:克隆鉴定的靶基因为目标病原的高度保守性基因,为PRV-PPV-JEV检测基因芯片的构建提供了确实可靠的材料。 2.PRV-PPV-JEV检测基因芯片的构建 本试验研究了PRV-PPV-JEV检测基因芯片靶基因和探针制备方法、靶基因杂交温度和特异性,确定了构建诊断芯片的靶基因及其浓度和有关芯片质量控制方法,结果如下。 1) 靶基因和定位对照基因的制备 以靶基因重组质粒DNA为模板,采用PCR扩增、异丙醇沉淀法纯化靶基因,其浓度和纯度符合芯片制作要求,定位对照基因制备参照曹三杰（2004）报道方法进行。 2) 探针的制备 以病毒DNA、cDNA和λDNA为模板,PCR扩增标记荧光素Cy3制备探针,Cy3-dCTP的使用终浓度为2.5 μmol/L,制备的探针浓度在121-748ng/μL之间。 3) 本试验确定了靶基因最适点样浓度为200ng/μL,芯片系统灵敏度为3pg/μL探针,筛选出杂交信号强、杂交特异性好的靶基因及其杂交温度,确定了PRV-PPV-JEV检测基因芯片的预杂交时间为1h和杂交时间为6h。 4) 数据分析采用QuantArray? Ver.3.0软件,数据量化使用总信号强度模式和信号中位值模式,总信号模式输出的样点信号强度与背景之比为SNR。 5) 基因芯片制备和质量控制 研究确定PRV gB、PRV gG、PRV TK、PRV gE、PPV B1 VP2、PPV SR-1 NS2、PPV SR-1 NS3、PPV SR-1 VP1、JEV C、JEV PrM/M、JEV E、